摘要：将某鸡场送检的病死鸡作为研究对象，分析其细菌性疾病的主要病原菌，通过分离培养、生化实验、免疫荧光抗体染色、药敏试验以及PCR试验等步骤，分析病原菌的形态特征，了解其耐药性，并将其PCR测序结果与GenBank数据库中的基因序列进行对比，对比结果表明病原菌为绿脓杆菌。
绿脓杆菌又被称作铜绿假单细胞菌，能够导致多种动物的脏器出现脓肿，所以绿脓杆菌可以从伤口的脓液中分离获得。各年龄段的鸡都会受到绿脓杆菌的感染，导致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病，死亡率高达80%。
1 实验材料
实验样品选取某鸡场送检的4只病死鸡，对其进行剖检，并在无菌环境下采集病死鸡的肝脏与肺脏；实验采用的试剂包括琼脂糖、DL2000DNAMarker、10×LoadingBuffer、肠杆菌科、JAMES液以及快速革兰氏染色液等；实验采用的培养基包括血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基等。
2 实验方法
（1）细菌的分离培养。在病死鸡的肝脏和肺脏中分离出细菌，通过划线方法将其接种于麦康凯平板、营养琼脂平板以及血液琼脂平板上，分别将3个平板放置于37℃的条件下培养24小时。然后选取其中的典型菌落，分别设置为1-4号，在典型菌落纯培养的过程中进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌。
（2）细菌的生化实验。根据肠杆菌科相关鉴定试剂盒中带有的说明书，对细菌分离培养中的纯培养物进行生化实验。实验的仪器为ATB自动生化检定仪，明确鸡源细菌的种属。
（3）免疫荧光抗体染色。在载玻片中滴加1滴PBS，并在培养基中挑取单个菌落均匀涂布在载玻片的PBS上，在菌落自然干燥后使用甲醇进行15分钟干燥；再使用PBS冲洗5分钟，共冲洗3次；然后在载玻片上添加一抗，在37℃的条件下孵育30分钟，再使用PBS冲洗之后添加二抗，在37℃的条件下孵育30分钟；最后使用PBS冲洗后使用蒸馏水漂洗，干燥后放置于荧光显微镜下观察。能够产生蓝绿色荧光素以及蓝色绿脓素的细菌为绿脓杆菌。
（4）药敏试验。制作绿脓杆菌的肉汤培养物，根据Kirby-Barer氏法，在营养琼脂平板的表面均匀涂布培养物。使用无菌镊子将20种抗生素的药敏试纸粘贴于培养基表面（需要注意的是，药敏试纸需要等距粘贴），然后将培养基放置于37℃的恒温培养箱中培养18~24小时。培养期间观察并记录试纸上的抑菌圈直径，按照NCCLS（2009）标准进行药敏试验结果分析。
（5）PCR试验。应用细菌纯培养物进行PCR试验，首先将其接种于普通LB液体培养基中，进行24小时培养，然后根据树脂型TM基因组DNA提取试剂盒中带有的说明书，进行分离菌株基因组DNA的提取，进一步鉴定绿脓杆菌。试验采用的上游引物序列为5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’，下游引物序列为5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。最后根据基因组DNA进行PCR反应，并通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，明确PCR产物的序列。
3 实验结果
（1）细菌分离培养结果。分离培养后，营养琼脂平板上的菌落呈现出表面光滑、边缘参差的形态，整体呈绿色，具有一定的芳香气味；麦康凯平板上的菌落呈半透明形态，整体为圆形；血液琼脂平板上的菌落为不规则形状，呈灰色，带有溶血环。通过显微镜观察，1~4号分离菌均为革兰氏阴性小杆菌，初步判定细菌为绿脓杆菌。
（2）生化实验结果。1~4号分离菌的生化实验结果相同，都可以分解酯酶、尿素酶以及D-葡萄糖，可以将其鉴定为绿脓杆菌，符合率高达99.9%。
（3）抗体染色结果。1~4号分离菌染色后在显微镜下呈现的形态为两端钝圆，颜色为荧光绿色，属于短小杆菌，与绿脓杆菌的特征相符。
（4）药敏试验结果。1~4号分离菌的药敏试验结果相差无几，对大观霉素、庆大霉素以及头孢曲松等药品高度敏感，对强力霉素以及四环素中度敏感，对红霉素以及头孢噻吩等药品不敏感，具有一定的耐药性。
（5）PCR试验结果。根据PCR试验获得的序列，将其与GenBank中公布的16株参考菌株进行同源性比对，比对结果显示，2号分离菌的同源性在99.7%~100%之间，可以将其鉴定为绿脓杆菌。
4 结论
综上所述，绿脓杆菌对于阿莫西林、头孢噻吩以及红霉素有较强的耐药性，对头孢曲松、阿米卡星以及庆大霉素等高度敏感，可以使用这类药品进行防治。
（张杨子 贵州省畜牧兽医研究所）
