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鸡源绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验

发布时间:2018-11-20 17:12    作者:.    来源:    查看:
    摘要:将某鸡场送检的病死鸡作为研究对象,分析其细菌性疾病的主要病原菌,通过分离培养、生化实验、免疫荧光抗体染色、药敏试验以及PCR试验等步骤,分析病原菌的形态特征,了解其耐药性,并将其PCR测序结果与GenBank数据库中的基因序列进行对比,对比结果表明病原菌为绿脓杆菌。

    绿脓杆菌又被称作铜绿假单细胞菌,能够导致多种动物的脏器出现脓肿,所以绿脓杆菌可以从伤口的脓液中分离获得。各年龄段的鸡都会受到绿脓杆菌的感染,导致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病,死亡率高达80%。

    1  实验材料

    实验样品选取某鸡场送检的4只病死鸡,对其进行剖检,并在无菌环境下采集病死鸡的肝脏与肺脏;实验采用的试剂包括琼脂糖、DL2000DNAMarker、10×LoadingBuffer、肠杆菌科、JAMES液以及快速革兰氏染色液等;实验采用的培养基包括血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基等。

    2  实验方法

   (1)细菌的分离培养。在病死鸡的肝脏和肺脏中分离出细菌,通过划线方法将其接种于麦康凯平板、营养琼脂平板以及血液琼脂平板上,分别将3个平板放置于37℃的条件下培养24小时。然后选取其中的典型菌落,分别设置为1-4号,在典型菌落纯培养的过程中进行革兰氏染色,在显微镜下观察细菌。

   (2)细菌的生化实验。根据肠杆菌科相关鉴定试剂盒中带有的说明书,对细菌分离培养中的纯培养物进行生化实验。实验的仪器为ATB自动生化检定仪,明确鸡源细菌的种属。

   (3)免疫荧光抗体染色。在载玻片中滴加1滴PBS,并在培养基中挑取单个菌落均匀涂布在载玻片的PBS上,在菌落自然干燥后使用甲醇进行15分钟干燥;再使用PBS冲洗5分钟,共冲洗3次;然后在载玻片上添加一抗,在37℃的条件下孵育30分钟,再使用PBS冲洗之后添加二抗,在37℃的条件下孵育30分钟;最后使用PBS冲洗后使用蒸馏水漂洗,干燥后放置于荧光显微镜下观察。能够产生蓝绿色荧光素以及蓝色绿脓素的细菌为绿脓杆菌。

   (4)药敏试验。制作绿脓杆菌的肉汤培养物,根据Kirby-Barer氏法,在营养琼脂平板的表面均匀涂布培养物。使用无菌镊子将20种抗生素的药敏试纸粘贴于培养基表面(需要注意的是,药敏试纸需要等距粘贴),然后将培养基放置于37℃的恒温培养箱中培养18~24小时。培养期间观察并记录试纸上的抑菌圈直径,按照NCCLS(2009)标准进行药敏试验结果分析。

   (5)PCR试验。应用细菌纯培养物进行PCR试验,首先将其接种于普通LB液体培养基中,进行24小时培养,然后根据树脂型TM基因组DNA提取试剂盒中带有的说明书,进行分离菌株基因组DNA的提取,进一步鉴定绿脓杆菌。试验采用的上游引物序列为5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’,下游引物序列为5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。最后根据基因组DNA进行PCR反应,并通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测,明确PCR产物的序列。

    3  实验结果

   (1)细菌分离培养结果。分离培养后,营养琼脂平板上的菌落呈现出表面光滑、边缘参差的形态,整体呈绿色,具有一定的芳香气味;麦康凯平板上的菌落呈半透明形态,整体为圆形;血液琼脂平板上的菌落为不规则形状,呈灰色,带有溶血环。通过显微镜观察,1~4号分离菌均为革兰氏阴性小杆菌,初步判定细菌为绿脓杆菌。

   (2)生化实验结果。1~4号分离菌的生化实验结果相同,都可以分解酯酶、尿素酶以及D-葡萄糖,可以将其鉴定为绿脓杆菌,符合率高达99.9%。

   (3)抗体染色结果。1~4号分离菌染色后在显微镜下呈现的形态为两端钝圆,颜色为荧光绿色,属于短小杆菌,与绿脓杆菌的特征相符。

   (4)药敏试验结果。1~4号分离菌的药敏试验结果相差无几,对大观霉素、庆大霉素以及头孢曲松等药品高度敏感,对强力霉素以及四环素中度敏感,对红霉素以及头孢噻吩等药品不敏感,具有一定的耐药性。

   (5)PCR试验结果。根据PCR试验获得的序列,将其与GenBank中公布的16株参考菌株进行同源性比对,比对结果显示,2号分离菌的同源性在99.7%~100%之间,可以将其鉴定为绿脓杆菌。

    4  结论

    综上所述,绿脓杆菌对于阿莫西林、头孢噻吩以及红霉素有较强的耐药性,对头孢曲松、阿米卡星以及庆大霉素等高度敏感,可以使用这类药品进行防治。

   (张杨子 贵州省畜牧兽医研究所)

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