王兴群 毛以智 张文磊
遵义职业技术学院动科系
遵义市动物疫病预防控制中心
近年来，猪病混合感染或继发感染日趋严重，由于其具有多因性、复杂性等特点，给猪病的正确快速诊断以及采取科学有效的防治措施带来了困难。猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、大肠杆菌病是严重危害养猪业的疫病，是高度接触性传染病，仔猪十分易感，一年四季均可发生，主要危害出生后几小时至断奶后2周内的小猪，尤以初生仔猪多发，呈地方性流行，一般表现为突然发生，病势急，造成仔猪出现严重败血症、腹泻和衰竭而死亡，发病率和死亡率均较高，给地方养猪业带来巨大经济损失。2012年底～2013年年初，遵义多家养猪场相继发生不明原因仔猪疫病，主要表现为仔猪体质弱、消瘦、腹泻，呼吸困难甚至突然死亡，为查明病因，对发病猪进行了实验室诊断，为本次疫情防控明确了方向。
1 试验材料与方法
1. 1 病料
实验室检测的患猪的病料随机采集自贵州省遵义市某养猪场。
1. 2 试剂
胰蛋白胨、酵母粉购自Oxiod 公司；药敏纸片均为购买临床用药后于实验室自制；新生小牛血清购自贵阳恒因生物有限公司。猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR 检测试剂盒（含RNA提取试剂盒）、猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒、猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒、猪圆环病毒2型PCR检测试剂盒均购自世纪元亨公司。
1. 3 流行病学调查
向畜主调查发病情况、临床症状，剖检病猪情况，记录结果。
1. 4 细菌检测
无菌采取病料肝脏、脾脏、心脏划线接种在鲜血琼脂平板培养基上，于无氧和有氧两种条件下，37 ℃恒温培养24 h，并对纯化细菌继续生物实验鉴定和药物敏感实验。
1. 5 C SFV 和PR R SV 的R T-PC R 检测
分别取病死仔猪病变肺组织、淋巴结、肾脏加适量D EPC水进行充分研磨，反复冻融3次后，按试剂盒说明书提取病料组织总RNA及RT-PCR扩增，20 μl RT-PCR体系如下：16. 8 μl RT-PCR反应液，1. 2 μl 酶混合液，2. 0 μl 模板。反应条件：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35个循环；72 ℃延长7 m i n。扩增产物以2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 猪繁殖与呼吸综合症（P R V ）和猪圆环病毒病Ⅱ型
PC V 2 的PC R 检测分别取病死仔猪病脑组织、淋巴结等研磨，反复冻融3次后按试剂盒说明书提取病料组织总DNA及PCR扩增，20 μl RT-PCR体系如下：16. 0 μl RT-PCR反应液，1. 2 μl酶混合液，2 μl模板。反应条件为：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35个循环；72 ℃延长7 m i n。扩增产物以2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2. 1 流行病学调查结果
该养殖场饲养母猪600头，公猪15头，哺乳仔猪1 200头，保育猪1 100头，育肥猪1 600～1 700头，各猪群均发生腹泻，其中，以2～3 日龄哺乳仔猪腹泻严重。剖检断奶前仔猪与保育猪可见淋巴结发紫出血，肾脏有明显出血点。
2. 2 细菌学检测结果
2.2.1 细菌分离与鉴定
无菌取送检病猪材料进行细菌分离培养，37 ℃培养过夜后，培养基表面长出灰白色、圆形、光滑、湿润、边缘整齐、微凸起菌落，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性杆菌。
2.2.2 药物敏感试验
取上述纯化细菌均匀涂于肉汤培养基上，选择常见兽用抗生素进行药物敏感试验，结果详见附表。从药敏试验结果可知，分离细菌对多种药物不敏感。建议：首选肠道康（乙酰甲喹）对病猪群进行治疗，对临床健康猪群进行预防性治疗，以控制病情扩散。
2. 3 猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病原核酸检测
采集病猪材料经试剂盒提取病料总R N A ，分别以猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）RT-PCR检测试剂盒对上述核酸样本进行目的基因扩增。
2. 4 猪伪狂犬病，猪圆环病病原核酸检测
采集病猪材料经试剂盒提取病料总DNA，分别以猪伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测试剂盒对上述核酸样本进行目的基因扩增。
3 讨论
当前引起仔猪发病死亡的原因很多，混合感染导致病情较复杂，诊断困难，防治效果不理想。由于同时存在几种病原混合感染，这些混合感染既有细菌与细菌、病毒与病毒、细菌与病毒，还有传染病和寄生虫病或普通病等。混合感染通过简单的流行病学调查、临床剖检等方法却很难分辨，必须通过实验室检测才能确诊，主要通过PCR[ 1，2]、RT-PCR[ 3]、RT-LAM P[ 4]、ELISA[ 5]等方法进行实验室诊断，必要时可做动物回归试验[6]。发生疫情时及时进行实验室诊断并采取对应的方案，可极大地减少损失。本病例经流行病学调查，实验室细菌学和分子生物学检测，确诊本次疫情应为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒Ⅱ型与大肠杆菌混合感染所致。
混合感染病例在我市很多猪场时有发生，并且有越来越多的趋势，应引起我们高度重视。混合感染病例必须进行系统的诊断，及时找出是由哪些病原共同感染引起。对于由多种病原混合感染引起的疫病，必须采取综合防治措施，强化免疫接种并加强饲养管理以及药物防治等，才能有效控制疫病的流行，减少死亡。
猪圆环病毒病是严重的免疫抑制性疾病，猪在感染猪圆环病毒Ⅱ型后，病毒在机体内的各种淋巴细胞中繁殖、复制，从而使猪体内的T淋巴细胞和B 淋巴细胞数量减少，导致患猪体况下降，形成免疫抑制，从而导致机体的免疫力大大下降。细菌感染后，由于不能科学的用药导致耐药菌株的不断增多、耐药谱日益扩大。这些疾病的发生都是相辅相成的，这也提醒我们需要进行综合防控。以高致病性猪繁殖与呼吸综合征为主的重大疫病危害巨大且广泛存在，要高度重视其综合防控，尤其要搞好平时的免疫。
