摘要：伴随猪联合育种的开展及人工输精技术的推广运用，猪精液低温保存技术已成为研究的热点。精液低温保存是通过降低或抑制精子新陈代谢、维持精子质膜及顶体结构完整性，延长精子体外存活时间。主要包括：液氮超低温（-196℃）冷冻保存、4～5℃低温“冷休克”保存以及15～17℃鲜精体外保存。
早期研究主要集中在低温保护剂和技术方法的筛选与优化，对猪精液低温保存进行了深入探索。近年来，有关猪精液低温保存过程中抑制猪精子低温损伤、延长精子的存活寿命及提高精子的受精能力等研究取得突破性进展。该文就近年来不同保存技术、保护剂及未来重点解决的问题进行简要概述，旨在为开展相关研究以及实际生产应用提供理论参考。
关键词：猪精液；低温保存；人工输精
前言
生态环境压力、饲料成本、疾病防控、国际市场竞争以及市场波动等诸多因素制约着我国生猪规模化养殖的发展。尤其是“十三五”期间国家生猪养殖“约束发展区”的规划实施，推进生猪改良及联合育种，加快生猪养殖业转型升级是破解制约当前产业发展的关键。
猪人工输精技术及猪精液体外保存是生猪联合育种的前提基础，猪精液体外保存期较短、精液中病原菌的存在成为阻碍限制生猪改良及实施联合育种的两大主要因素，在一定程度上限制生猪养殖产业的转型升级及产业化发展。优质种猪精液体外保存方式主要采用液氮超低温（-196℃）冷冻保存、4～ 5℃低温“冷休克”保存以及15～17℃鲜精体外保存。
目前，生猪养殖业中主要利用新鲜精液人工输精繁殖为主，但所使用的鲜精液体外保存的时间一般不超过3d，鲜精体外保存时间短且精子质量下降较快，极大影响公猪精液的利用效率，致使公猪保有量增加，影响养殖的经济效益，故限制生猪改良及联合育种的推进。因此，构建猪精液体外超低温冷冻保存长期保存体系及4～5℃低温“冷休克”保存体系，提高优质种公猪利用率是当前生猪养殖业亟待解决的问题。本文对近五年来猪精液体外低温保存技术相关研究进行简要概述。
1、超低温冷冻保存技术进展
超低温冷冻是猪精液体外保存常用的技术之一，然而过去一直处于瓶颈状态，其原因主要是猪精子质膜中富含不饱和脂肪酸，极易受到冷冻应激伤害失去稳定性和选择通透性，Ca2+、HCO3-和稀释液中的一些成分进入精子内，扰乱精子生理平衡，促使蛋白质和mRNA降解，导致冻融精子质膜、顶体及核的稳定性遭到破坏，线粒体功能和精子活力及存活率显著降低，人工授精妊娠率及窝产仔数均有所降低。
因此，2013年以前世界上应用猪冷冻精液进行人工授精的母猪量不到1%。近年来，超低温冷冻保存技术取得快速发展，稀释防冻保护剂的改进、冷冻及解冻速率优化、乳化剂及抗氧化剂的运用，猪冻融精子顶体、质膜结构完整性及核遗传物质结构稳定性均得到显著提高，猪冻精繁殖效率已经达到甚至略优于鲜精指标。
卵黄和乳糖是最常用的猪冷冻精子非渗透性保护剂，免受精子低温应激伤害，阻止Ca2+内流。一些高分子化合物（如 ：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇和葡聚糖）亦提高冷冻保护作用。甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙烯、甲醇、丙烯和二甲基乙酰胺是猪冷冻精子渗透性保护剂，其中甘油适宜浓度为2%～3%。非渗透性冷冻保护剂作用于细胞外，同时可以提高渗透性保护剂的保护性能。
如主成分十二烷基磺酸钠的Orvus ES Paste，一种表面活性剂，促进卵黄蛋白和精子质膜的相互作用。冷冻程序也有进一步优化，尤其是两步降温法保存以及麦细管于40℃水浴中解冻等程序的优化显著提高冻融精子的活力等宏观指标。实验证明，添加50%精清的保护效果优于添加10%的精清。猪精子在超低温冷冻保存过程中除受到低温机械损伤外，还要遭受ROS等自由基的氧化损伤。因此，抗氧化剂是猪精子超低温冷冻保存技术中常用的成分。
近年来研究证实，冷冻稀释液中添加抗氧化剂可以增加冻融精子的质量以及人工授精后的繁殖效率。然而，并非所有的抗氧化剂都能提高猪冻融精子的质量及受精潜能。研究显示，还原性谷胱甘肽、L-半胱氨酸、α-生育酚、丁基苯甲醇和维生素C对于超低温冷冻保存猪精子是较为有效的抗氧化剂。此外，抗氧化剂的结合使用能够有效提高冻融精子人工输精的产仔数，例如维生素C结合还原型谷胱甘肽共同使用，能有效提高猪冻融精子的质量。
此外，辅助保护剂以及子宫深度输精技术有利于提高冻精的繁殖效率。丹参多糖、丁羟甲苯、前列腺素F2α以及咖啡因与氯化钙的联合使用显著提高冻融精子的活力；含一定量胆固醇的环糊精（CLCs）有利于增强冻融精子的抗冻性，尤其是用来提高冻融质膜中胆固醇的丰度及精子的质膜完整性。人工输精主要包括传统体内或者子宫颈内输精、子宫内输精以及子宫内深度输精3种方式，繁殖生产实践证实子宫内深度输精适合猪冻精繁殖生产。
尽管在猪精液冷冻保存技术方面取得显著成绩，受胎率及产仔数已经达到甚至略高于鲜精繁殖指标。然而，国内外猪冻精繁殖生产存在的共性问题是受限于制备冻精的鲜精液质量，活力低于0.8的精液不利于制备冻精，因而限制了种公猪精液的冻精制备利用率，这也是未来研究需要解决的主要问题。
2、4～5℃低温“冷休克”保存技术进展
相对于液氮超低温冷冻保存，4～5℃低温“冷休克”保存能有效减少液氮冷冻所产生的机械损伤，同时能有效节约生产成本。同时，低温“冷休克”精子代谢水平低于37℃条件下的代谢水平，能有效缓解精子能量的消耗。生产运输成本和操作技术与常温精液基本相同，有效提高优良种畜利用率及联合育种的推广，具有很广的应用前景。过去猪精液体外保存相关研究主要集中于液氮超低温冷冻保存和鲜精15～17℃保存，而4～5℃低温保存研究较少。
近年来，大多数研究主要集中于精液4～5℃保护剂的筛选、代谢调控以及抗氧化剂的筛选。其中糖代谢是家畜精子能量的主要来源之一，而葡萄糖、果糖及蔗糖是常用的保护剂成分，亦是主要能量来源物质。尽管不同稀释液的研究试验方法和使用效果不同，其组成主要由葡萄糖、果糖、柠檬酸（钠）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钙、碳酸氢钠等成分构成，作用包括营养、pH调控、缓冲性、渗透压和低温保护性能等。
目前脱脂奶粉的加工工艺已经达到先进水平，有害细菌数已完全符合世界卫生组织标准，所以较多研究者倾向于向精液稀释液中添加脱脂奶粉。Pagl等(2006)研究证实，在精液4～5℃保存添加脱脂奶粉可以有效维持精子活力约两周，甚至在4～5℃条件下保存猪精液脱脂奶粉的效果要优于全乳，故脱脂奶粉在猪精液稀释液中的应用更加广泛。
研究证实，牛奶中的乳铁传递蛋白对维持精子活力、运动能力和获能发挥重大作用。此外，添加奶类物质可以降低精液中电解质浓度，调节精液渗透压，从而保护精子质膜的完整性及线粒体的活性。精子代谢过程中相应酶活性是代谢信号通路激活的关键，尤其是GAPDH、AMPK的活性以及线粒体活性直接调控精子代谢过程。因此，2～5℃低温“冷休克”保存过程中，猪精子酶活性以及线粒体活性的维持对复苏后精子的活力及寿命起到至关重要作用。
此外，精子体外保存过程中的活力降低与精液中富集的活性氧离子（ROS）密切相关。猪精子质膜中含有高浓度的不饱和脂肪酸，极易发生氧化损伤，病理水平下ROS导致精子质膜发生氧化应激。因此，精液稀释液中添加抗氧化物质尤为重要，能减少精子细胞内多余的ROS生成量，抵抗ROS造成的氧化压力，提高精子自身的抗氧化特性，维持精子活力，延长体外保存时间。
常见的抗氧化剂包括酶类抗氧化剂（如：过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等）和非酶类抗氧化剂（如：维生素C、维生素E、半胱氨酸）等。研究证明，不同抗氧化剂的使用对于猪精子体外4～5℃保存均有积极效应。目前，4～5℃低温“冷休克”保存猪精子的存活时间能达到10d，活力能够维持在0.5以上。但尚无4～5℃低温条件保存的猪精子人工输精后母猪受胎率、产仔数等繁殖指标报道。
3、鲜精 15 ～ 17 ℃保存技术进展
鲜精体外15～17℃保存是国内外现普遍采用的猪精液保存技术方法，其人工输精繁殖效率与自然交配繁殖相似。然而体外保存时间相对较短，有效利用期不超过5d，因而极大限制鲜精的利用率。随着养猪业人工授精技术的发展，对猪精液15～17℃条件保存所用的稀释剂成分及添加物提出更高要求，尤其是强化精子宏观指标检测，准确反映精子有效存活期及质量特性，为指导实际生产奠定理论基础。
近年来，研究重点主要集中在稀释剂成分及抗氧化剂的筛选，除常规使用的葡萄糖、柠檬酸（钠）、氯化钙、碳酸氢钠及三羟甲基氨基甲烷（Tris）等稀释剂成分之外，BSA、脱脂奶粉及环糊精等成分亦用作猪精液15～17℃保存稀释剂成分，能有效提高猪精子体外保存的活力参数指标，延长精子存活寿命，使保存的猪精液有效利用期增至5d以上，显著提高优质种公猪精液的利用率。
Fu等（2017）利用超声处理过的脱脂奶粉，17℃保存猪精液7d后，精子GAPDH活性、线粒体膜电位及ATP含量显著高于对照组，添加BSA及脱脂奶粉的处理组能有效抑制猪精子蛋白的脱磷酸化及乙酰化。Carla等（2017）利用蔗糖及糖分解酶17℃保存猪精液，保存10d后能显著提高精子活力、前向性运动、质膜完整性以及顶体完整性。选取135头母猪进行生产性实验，受孕率及产仔率分别为97.8%、96.3%，证实添加蔗糖及糖分解酶能够满足17℃保存过程中猪精子的代谢需求。
过氧化损伤是精子体外保存过程中诱导活力降低重要因素之一。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽、维生素C及维生素E、牛磺酸、硫辛酸等是超氧化物和过氧化氢的抗氧化剂，添加抗氧化剂能有效提高精子的抗氧化损伤能力。Li等（2017）在猪精液稀释液中添加不同浓度的牛磺酸显著提高17℃精子的活力、存活时间及抗氧化能力，保存7d后精子活力达到0.5以上；Zhang等（2016）在稀释剂中添加5mmol/L谷胱甘肽，能有效延长猪精子17℃保存的存活时间，显著提高精子活力、质膜及顶体完整性、抗氧化能力（T-AOC），降低MDA及H2O2水平。
Zhang等（2016）在稀释剂中添加不同浓度的超氧化物歧化酶（SOD），其中浓度200U/mL SOD处理组精子活力、质膜完整性及顶体完整性、T-AOC显著提高，MDA与H2O2水平显著降低。Fang等（2017）研究证实，稀释剂中添加80μM碘甲硫氨酸(IM)17℃保存6d后，精子活力、质膜及顶体完整性没有显著变化，但80μM碘甲硫氨酸组产仔数明显高于对照组，且能有效抑制猪精液中变形菌、葡萄球菌等细菌微生物的扩繁。
4、猪精液中病原微生物的影响及应对措施
猪精子中不饱和脂肪酸含量高致其对低温损伤较为敏感是限制猪精液低温保存技术发展的一个主要因素。除此之外，猪精液普遍存在的细菌、病毒等病原微生物亦是影响猪精液低温保存宏观指标的又一大限制性因素。研究证实，猪精液中含有50多种细菌微生物，如大肠杆菌、变形杆菌、沙雷菌、肠杆菌、克雷伯菌、葡萄球菌、链球菌和假单胞菌等。
无论是17℃保存，还是4～5℃低温保存，均会对精子活力、成活率、质膜及顶体结构产生较大的破坏作用。猪精液中细菌等微生物部分属于内源性，来自于公猪的包皮、尿道、外生殖器及泌尿生殖感染等因素均可能导致精液被细菌污染，而多数来自采精器具、稀释液及保存环境等人为过程中缺乏相应的卫生条件，尤其高温季节病原菌的滋生以及耐药性病原菌的产生，是精液中病原菌防控的难题，而传统病原菌防控策略已经无法满足实际生产需求。
低温保存过程中细菌等病原菌对猪精子质量产生较大的影响，主要体现诱导精子发生凝集现象，降低精子运动参数等质量特性，诱发破坏精子顶体完整性，抑制精子特异性蛋白质磷酸化水平，降低精液pH以及母猪产仔数等生产性能。猪精液中细菌菌落浓度一般为103～105cfu/mL，而菌落浓度大于103cfu/mL时会对精子质量造成不良影响。有关细菌与猪精子质量的研究常用商用菌种作为实验材料，而这些菌株一般具有高致病性，无法准确评估精液中细菌对猪精子的影响。
目前家畜精液中病原菌的存在已经引起国外饲养业广泛重视，美国、法国、加拿大及巴西等国家陆续开展家畜动物精液中细菌等微生物病原菌的防控研究，尤其抗生素耐药菌的种类筛选、防治以及致病机理方面已经取得初步成效，为进一步开展精液中病原菌的防治研究以及相关新产品研发奠定基础。
5、小结与展望
综上所述，猪精液低温保存技术有所突破，尤其是保护剂成分的筛选、优化以及抗氧化损伤方面取得突破性进展。然而，猪精液中病原菌的存在、高温季节精子质量显著降低等限制性因素影响低温保存精子质量，猪精液低温保存技术尚需进一步改进提高。
未来相关研究重点主要聚焦以下几方面：一是液氮超低温冷冻保存技术在原有保护剂成分基础上尚需进一步优化，维持冻融精子结构完整性及精子膜通透性，维持精子中关键蛋白结构及修饰的生物学功能，克服冻精繁殖效率低的瓶颈，提高活力相对较低的精液冻精利用率；
二是在糖代谢及氧化磷酸化生理调控基础上，有效延长精子低温体外保存时间，深入了解和揭示低温保存过程精子活力降低的分子机理，建立4～5℃猪精液体外保存技术体系；
三是新鲜精液15～17℃保存过程中细菌等病原微生物的防控研究，开展家畜精液病原微生物多样性分析、感染家畜动物精子的致病机理以及综合防治研究，制定家畜动物精液病原菌安全标准，构建家畜动物病原菌的防控体系，扩大养殖企业生存和发展空间，实现地区养猪业加快转型升级及可持续循环发展是目前亟待解决的问题。
通过结合低温生物学的相关知识及对精子低温损伤分子机理探索，可为猪精液低温存研究提供理论指导，最终提高优质种公猪的高效利用率及繁殖效率。
（李新红、李步社 猪业科学）
