摘要：鸡胚培养是培养某些病毒的常用方法，可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。现代化大型生物制品厂采用尿囊腔接种法培养病毒液用于生产疫苗，生产实践早已证明，种蛋的质量、抗原生产工艺对生成尿囊液量及其效价高低起决定作用，直接影响产品质量和鸡免疫后的抗体水平。本文结合某些大型兽用生物制品企业生产案例，对病毒鸡胚培养进行阐述。
近年来灭活苗的应用越来越广泛,对禽病的防制也起着越来越重要的作用。虽然组织培养和生物工程技术的发展很快,但是鸡胚培养技术仍因其来源充足、操作简单和投入少等优点被广泛地用于病毒的分离、鉴定和抗原制备,尤其是兽医生物制品的制造。几种主要禽用疫苗如鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)和传染性支气管炎(IB)等疫苗病毒液的生产均采用鸡胚培养的方法。
1 病毒鸡胚培养
鸡胚（包括鸭胚）是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代, 并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。
（1）鸡胚培养法的优点。胚体通常无菌，对接种的病毒不产生抗体，易于病毒增殖。鸡胚来源充足，可选择不同的日龄和接种途径，设备和操作简便。感染病毒的组织和尿囊液中含有大量病毒，容易采集和处理。
（2）鸡胚培养法的缺点。鸡胚用量巨大，生产过程中需要大量人力进行鸡胚接种和收获操作。卵黄含有因母鸡免疫而产生的母源抗体，影响同种病毒的增殖。容易导致外源污染，细菌如沙门氏菌等，经母鸡垂直传递的病毒，如禽白血病病毒及新城疫、禽脑脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。
（3）鸡胚培养接种方法及途径。鸡胚培养病毒根据接种途径主要有绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、卵黄囊接种和羊膜腔接种方法，根据需要选择适当的途径。尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒，减蛋综合征病毒分离和增殖。病毒液接种于10~11日龄尿囊腔，每胚0.1mL。绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。选用10～12日龄鸡胚制造“人工气室”，用注射器滴2～3滴种毒液于绒毛尿囊膜，用透明胶纸覆盖卵窗，周围涂以熔化石蜡进行密封，气室小孔亦用石蜡密封。所有鸡胚接种完成后人工气室向上横放，置于孵化箱中，期间禁止翻动。卵黄囊接种主要用于虫媒披膜病毒及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。选用6～8日龄鸡胚，气室向上垂直放置，用碘酊和酒精消毒气室端，气室顶端中央打孔，用灭菌注射器吸取含病毒悬液，沿气室端小孔剌入约3cm，注入0.1～0.5mL种毒液于卵黄囊内。
石蜡封孔后置孵箱内继续孵育。羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。病料初次分离病毒时，羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。选用11～12日龄的鸡胚，按绒毛尿囊膜接种法造“人工气室”，撕去卵壳，并剌破绒毛尿囊膜血管较少的部位，用钝端镊子沿此破孔插入，夹起羊膜囊,注入0.1～0.2mL种毒液。
2 大型生物制药厂的鸡胚培养
目前，国内大型生物制品厂的病毒鸡胚培养，生产批次3~10万枚/批，均采用全自动设备进行鸡胚接种和抗原收获取代人工操作，生产效率得以大幅提高。鸡胚尿囊液收获量及其病毒含量的多少直接影响疫苗的产量和经济效益，决定生物制品的质量。因此，做好鸡胚的质量、种毒筛选和生产过程关键点控制非常必要，如种蛋选择、储存及孵化前处理，鸡胚孵化过程和生产工艺等。
（1）种蛋选择。鸡胚的质量主要取决于种蛋质量，要想得到效价和产量高的病毒液，首先要选择优质种蛋，SPF种蛋最为理想。根据行业标准要求选用SPF蛋最佳，即来自不含鸡22种病原体的鸡群产的蛋，适用于生产各种鸡用疫苗。但SPF蛋受价格高、供应量不足、禽灭活苗抗原用量大，成品苗价格不高等因素影响，禽灭活苗用非免疫种蛋生产。非免疫种蛋指来自于未接受特种病原体免疫和未感染此种病原体的鸡群，即种蛋不含特定病原的母源抗体。大小均匀，蛋重55～65g。种蛋孵化至10日龄胚的有效率达90%以上。蛋壳表面较光滑，无粪便污染。蛋壳钙质均匀，无破壳、薄壳和花壳蛋。选择不含特定病原母源抗体的
非免疫种蛋，卵黄抗体水平符合质量标准。
（2）种蛋储存。用于疫苗生产的种蛋13~18℃保存期在1周以内。胚胎发育的临界温度是23.9℃。高于这个温度胚胎就会发育，低于这个温度胚胎就会停止发育。但决不能认为种蛋储存只要低于23.9℃就行，因为胚胎在低于23.9℃的某一温度范围内，胚胎的生理代谢仍然存在，在这种条件下储存的种蛋活力就会降低，当转入正常孵化时胚胎衰弱，死亡增加，影响孵化效率。所以种蛋储存时，要使胚胎的生理代谢降到最低程度，同时又不能使种蛋受冻（不得低于 5℃）。种蛋保存时间在产后1周内为宜，最好控制在3～5天。种蛋保存1周以内可不翻蛋，如保存期超过1周以上每天翻蛋1～2次，可防止胚胎与蛋壳膜粘连，有利于提高种蛋孵化率。种蛋储存间温度控制在13~18℃。根据各地区气温高低和储存时间长短而异，种蛋保存时间短，温度控制的高些，保存时间长，温度适当低些。保存期越长，孵化效果不佳，即使在最适宜的环境下，保存期也不宜超过10天。储蛋库的相对湿度控制在70%~80%。种蛋在储存期间，蛋内水分通过蛋壳蒸发，湿度低水分蒸发快，反之水分蒸发慢。种蛋进入种蛋库前应及时消毒，并对接触种蛋的蛋箱、蛋托和蛋架等用福尔马林或过氧乙酸熏蒸消毒。储存前不能用水洗刷种蛋，否则会导致蛋壳上的胶质膜破坏，降低种蛋品质使孵化率降低。做好通风，使种蛋库内空气新鲜不能有异味，防止产生臭蛋和霉蛋。
（3）种蛋孵化前的处理。入室孵化前除去种蛋表面污物，并进行消毒处理。用挑选和磨砂处理的方法去除表面有污物的种蛋。经选择的种蛋按28mL/m³福尔马林、14g高锰酸钾密闭熏蒸半小时, 可杀灭蛋壳上95%~98.5%的病原体。种蛋入孵前用0.1%新洁尔灭浸泡消毒,可以防止霉菌及病原微生物增殖而污染种蛋。种蛋大头向上置于蛋盘内，装蛋车推入孵箱开始孵化。
（4）鸡胚孵化过程控制。高质量鸡胚需要适宜的孵化条件，包括温度、湿度、翻蛋和通风。孵化过程中，温度是最重要的影响因素，关系到种蛋孵化率的高低和鸡胚品质的好坏。前孵温度设置为37.8±0.5℃，后孵温度为37.0±0.5℃。温度偏高导致鸡胚发育过快,收获时尿囊液量少；温度偏低胚胎发育慢,10~11日龄的鸡胚血管网发育不到胚蛋的小头，种蛋蛋白不能被吸收转化成尿囊液，收获量也会减少。湿度前、后孵化均设置为65±5%，湿度过大,超过70%会妨碍蛋内水分蒸发和胚胎发育；湿度过低,蛋内水分大量蒸发,胚胎同样发育不良且接种后尿囊液减少,影响抗原产量。翻蛋2小时/次，翻蛋的角度要达到左右各45°。翻蛋是胚胎正常发育不可缺少的条件之一。有报道称翻蛋对胚胎的发育和生理学有积极作用，可保持胚外囊（尿囊、羊膜囊、蛋白囊和卵黄囊）的正常方位和胚胎的水平衡，有利于胚外囊的生长和胚胎营养的吸收。通风换气直接影响胚胎正常新陈代谢和孵化效果。随着鸡胚胚龄的增长,其代谢能力增强,氧气的需求量增多,如不及时排出污浊气体、换入新鲜空气，胚胎发育会受到严重影响，严重时可造成鸡胚死亡率升高。
（5）生产工艺。生产工艺的影响因素包括接种和收获时鸡胚的日龄、病毒种类及接毒剂量、接种收获设备稳定性和接种胚收获前冰蛋处理。接种9~11龄鸡胚，13~14日龄收获时的鸡胚尿囊液量最多。种毒效价必须符合质量标准要求，高质量的种毒才能生产出合格的抗原。不同类型病毒在鸡胚内繁殖规律及对鸡胚发育的影响不同，不同抗原制造执行各自的生产工艺。接种开始前接种设备的管道、接种针和种毒瓶等物品灭菌处理，避免污染引起鸡胚死亡。根据胚蛋大小调节接种针的进针深度，既要保证种毒接进尿囊腔内，又要避面进针过深扎死鸡胚。观察接种针是否有弯曲和倒刺，刺破或刮断血管造成接种胚的死亡率增加。后孵化结束后鸡胚做冰蛋处理，目的是让鸡胚血管收缩，防止收获时血管破裂红细胞进入抗原，影响抗原质量。-20℃冷库2~4小时或2～8℃冷藏过夜，冰蛋时间视胚蛋总量和冷库制冷量灵活把控。-20℃条件下控制好时间防止冻结，解冻后收获尿囊液收获量会减少10%~20%；2～8℃冷藏气室向上直立4~24小时，冷藏时间过长收获量也会减少。冷却的鸡胚取出，用消毒剂消毒气室部位。剥除气室部蛋壳，穿破卵壳膜和绒毛尿囊膜，通过负压真空收取尿囊液并存放于灭菌容器内。收获头的高度，真空压力适宜，避免收获头过低压破蛋黄影响抗原质量。收获头过高或真空压力过低，尿囊液收取不净影响收获总量。
综上所述，病毒鸡胚培养应用广泛和成熟，给予适宜病毒繁殖扩增的生理生化条件，选用优质鸡胚，控制好孵化温湿度，按照工艺规程和岗位操作SOP组织生产，能得到高质量的抗原用于制备优质疫苗，并获得良好的经济效益。
（上海海利生物技术股份有限公司 孙爱喜）
