轮状病毒（Rotaviruses,RVs）中的A群、B群和C群已经被确认为是猪腹泻的重要病原，其中A群轮状病毒是猪群中最常见的引起腹泻性疾病的主要病原。幼龄仔猪最为易感，1～4周龄仔猪发病率超过80%，死亡率达7% ～20%，症状也较严重。同时，由于该病常与其他疾病混合感染，使病情加重，导致死亡率增高，给养殖户带来严重的经济损失。本研究根据猪A群轮状病毒的NSP4基因建立了一步法RT-PCR检测方法，为猪A群轮状病毒病的检测提供了技术支持。
1、材料
1.1、样品
猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒；猪瘟病毒活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗。
1.2、主要试剂
TRIzol® Reagent提取试剂盒、Prime ScriptTM one Step RT-RCR kit Ver.2试剂盒、DL-2000 Marker、溴化乙锭。
1.3、引物
根据GenBank上登录的猪A群轮状病毒的NSP4基因（登录号为KU363142.1）序列利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物。引物序列F：5＇-GTGCGGAAAGATGGATAA-3＇；R：5＇-CATTCGCTGGATTGGTTA-3＇。扩增目的片段大小为683 bp。
2、方法
2.1、RNA模板的制备
取250 μL的样品加入750 μL TRIzol中，颠倒混匀后室温静置3～5 min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混合15 s（也可以用手反复颠倒混匀），4 ℃下13 000 r/min 离心15 min；小心吸取约500 μL上清液转移至500 μL异丙醇中，颠倒混匀，室温下静置15 min，4 ℃下1 300 r/min 离心10 min；弃上清液，加入1 mL 75%的DEPC乙醇，4 ℃下13 000 r/min离心10 min，洗涤2次，干燥后用20 μL DEPC水溶解沉淀，－20 ℃保存，备用。
2.2、一步法RT-PCR反应体系及反应程序
采用50 μL反应体系，通过对RT-PCR反应体系及反应程序的优化，确定RT-PCR反应体系：2×1 Step Buffer 25 μL，RNase Free H2O 20 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，模板2 μL。
反应程序为：50 ℃反转录60 min，94 ℃预变性90 s；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭）电泳检测，然后用凝胶成像系统分析。
2.3、特异性试验
利用优化后的反应体系和反应程序对猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒进行检测，并设立无模板阴性对照。
2.4、敏感性试验
利用优化后的反应体系和反应条件，将猪A群轮状病毒的RNA进行10倍倍比稀释至1×10-5，即浓度分别为13 170，1 317，131.7，13.17，1.317，0.131 7 pg/μＬ，然后进行RT-PCR扩增，以检测该方法的敏感性。
2.5、重复性与稳定性试验
利用优化后的反应体系和反应程序，分3次提取猪A群轮状病毒的RNA，并平行进行3次RT-PCR扩增。
2.6、临床应用
应用建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法对临床腹泻样品进行检测，同时设立阳性对照、无模板阴性对照。并选取14份猪A群轮状病毒扩增阳性样品进行序列测定，并与NCBI上基因库进行序列同源性比较。
3、结果与分析
3.1、扩增结果
提取猪A群轮状病毒的RNA，进行RT-PCR扩增反应。结果显示RT-PCR可扩增出NSP4基因的目的条带，无模板阴性对照无目的条带。
3.2、特异性试验结果
利用优化后的反应体系和反应程序对猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒进行检测。结果显示仅以猪A群轮状病毒的RNA为模板时能扩增出特异性目的条带。表明该方法具有较高的特异性，与其他病原无交叉反应。
3.3、敏感性试验结果
将猪A群轮状病毒的RNA进行10倍倍比稀释至1×10-5，进行PCR检测电泳检测结果显示最低可以检测到的浓度为13.17 pg/μＬ。
3.4、重复性与稳定性试验结果
3次平行RT-PCR扩增结果表明该方法具有良好的重复性与稳定性。
3.5、临床样品检测结果
应用建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法对30份临床腹泻样品进行检测，结果样品阳性率为90%（27/30）。同时选取14份猪A群轮状病毒扩增阳性样品进行序列测定，应用在线软件进行BLAST比对，结果发现测定序列与GenBank中的其他猪A群轮状病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。表明本试验建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法能够成功地用于临床样品的检测。
4、讨论
动物疫病及时、准确的诊断是有效控制疫病蔓延的关键。随着分子生学技术的发展，越来越多的新技术被广泛应用于动物疫病诊断中，其中PCR技术是各种动物疫病诊断技术中应用最成熟的方法之一。本研究建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法与一般RT-PCR方法相比，不仅操作简便，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。本方法灵敏性高、特异性强、稳定性好。通过临床应用表明该方法可对A群轮状病毒做出准确的诊断，可以很好地应用于猪A群轮状病毒病的临床诊断。
（赵凤菊、关淼、李井春、关乃鹏、陈瑶、赵晓彤 黑龙江畜牧兽医杂志社）
