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猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊治分析

发布时间:2017-12-15 17:58    作者:.    来源:    查看:
    猪链球菌病是由多种不同血清群(C、D、E、L群)的链球菌引起的不同临诊传染病的总称,临床上主要是以淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎以及败血症为主要特征,其中,猪链球菌是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原,该菌可引起猪脑膜炎和败血症等症状,并能通过黏膜或者伤口等传播途径感染人。

    猪是多杀性巴氏杆菌的易感动物之一,猪群中流行的多杀性巴氏杆菌血清型多为A型和D型,主要引发猪肺疫和猪进行性萎缩性鼻炎。近年来,猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染病例报道较少。2017年2月下旬,河南濮阳某800头基础母猪规模化场,保育后期、育肥前期的猪群陆续发病,送来我单位诊断,笔者通过临床综合诊断和实验室诊断,确诊为猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染,现将报道如下。

    1、临床症状

    该猪场存栏保育后期、育肥前期的猪群约1 500余头,50~120日龄,从2月上旬,相继陆续发病,表现为精神沉郁,食欲减退,体温升高为41~42℃,眼结膜潮红,腹式呼吸,喘气,四肢无力,趴卧地面,耳廓、腹部、四肢皮肤有紫红色出血斑块(图1);有的猪晚上发病、早上死亡,口鼻流出血样泡沫 ;有的关节肿大、跛行;有的保育仔猪头颈歪斜,共济失调,走路摇晃,病程长的保育仔猪严重消瘦。整个猪场自发病以后,发病率约为40%,死亡率约为15%,使用氟苯尼考、替米考星、强力霉素等,疗效不明显。

    2、剖解病理变化

    腹股沟淋巴结肿大(图1),颌下淋巴结肿大;心包积液(图2),心包液内有少量的纤维性物质;有的猪心外膜有大量纤维素物质包裹,呈绒毛心;气管内有大量出血泡沫液体;肺脏出血,呈紫红色,有肉变区,有的猪肺气肿,切面流出泡沫样液体;有的猪肾脏针尖状出血点;关节积液增多,内有纤维絮状物。
图1 腹部皮肤出血和腹股沟淋巴结出血
图2 心包积液

    3、实验室诊断

    3.1、主要试剂

    TSA(胰蛋白大豆琼脂)、TSB(胰蛋白大豆肉汤)购自美国BD(Becton,Dickinson and Company)公司;TSA平板、TSB肉汤配制时,分别添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)终浓度为10mg/L和犊牛血清(终浓度50mL/L);2×Taq PCR MasterMix/with dye购自加拿大ABM公司;Marker 2000等购自宝生物工程(大连 )有限公司;药敏片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

    3.2、引物与合成

    猪链球菌特异性扩增引物,参照文献,
    P1:GCAGCGTATTCTGTCAAACG,P2:CCATGGACAGATAAAGATGG

    预期扩增片段大小为689bp;多杀性巴氏杆菌特异性扩增引物,参照文献,
    P1:5 ′ -ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3 ′,
    P2:5 ′ -GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′
    预期扩增片段大小为457bp,均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    3.3、分离、培养

    无菌采集患猪肺脏,引火自燃消毒肺脏表面,使用灭菌剪刀与镊子,剪去肺脏表面,采集深部肺脏组织,涂抹于TSA平板(添加有NAD,犊牛血清),37℃培养24~48h,生长出一种白色、半透明、圆形菌落,约为0.5~1mm;

    另外一种淡浅色、圆形、湿润菌落,大小约为1~1.5mm,进一步将两株菌落接种于 TSA 平板(添加有NAD,犊牛血清)纯化、传代。

    3.4、染色、镜检

    无菌采集病变部位的肺脏组织,染色后,观察到疑似两种细菌,一种为革兰氏阳性、单个或短链球菌,另外一种为革兰氏阴性短杆菌或个别稍长杆菌(图3)。

图3 肺膈叶病料中疑似链球菌、巴氏杆菌(革兰氏染色)

图4 分离链球菌(革兰氏染色)

图5 分离多杀性巴氏杆菌(革兰氏染色)

    将分离、纯化的可疑菌,染色、镜检,观察到一种为革兰氏阳性、链状排列的球菌,疑似猪链球菌(图4);另外一种为革兰氏阴性、卵圆性的短小杆菌,疑似为多杀性巴氏杆菌(图5)。

    3.5、PCR鉴定

    根据参考文献,利用PCR方法,扩增疑似为猪链球菌、多杀性巴氏杆菌的特异性片段,结果显示扩增出猪链球菌689bp特异性片段、多杀性巴氏杆菌457bp片段,与预期一致(图6),表明分离两种细菌为猪链球菌和多杀性巴氏杆菌。

图6 分离细菌PCR鉴定结果

    3.6、药敏试验

    选择18种药物,采用纸片扩散法,测定分离的猪链球菌和多杀性巴氏杆菌药物敏感性,其结果见表1。结果表明猪链球菌和多杀性巴氏杆菌对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、环丙杀沙星菌等敏感,因此,建议该养殖户,针对发病严重猪只,使用氨苄西林、青霉素、或者恩诺沙星单独,或者联合注射治疗,同时使用阿莫西林拌料,适当加大用药剂量,连用5~7d。


    治疗效果明显,1周后,该猪场疫情平息。

    4、分析与讨论

    通过临床症状与病变,容易诊断为急性传染性胸膜肺炎,因此笔者采用TSA 平板(加有NAD、犊牛血清)分离发病猪群感染的病原,是为了判断能否分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌,及副猪嗜血杆菌(该培养基,能够适合这两种菌的生长)。

    实验结果显示分离到的两种细菌分别为猪链球菌和多杀性巴氏杆菌,结合临床症状和病理变化,最终确诊为猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染,混合感染时,病情更加复杂,增加诊断难度,必须依靠实验室检测才能确诊。

    根据养殖户反映,使用氟苯尼考、替米考星、强力霉素等药物,疗效不佳,笔者推测猪群感染耐药性菌株所致。因此,分离猪链球菌和多杀性巴氏杆菌,进行药物敏感试验,结果显示,氨苄西林、阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、环丙沙星等药物敏感。

    最后,根据药敏试验结果,使用氨苄西林、青霉素、或者恩诺沙星联合注射治疗,阿莫西林拌料给药,适当加大剂量,疗效明显。兽医临床中,由于滥用药物,耐药性问题相当严重,分离病原菌、进行药敏试验,对于正确指导用药十分重要。

(卢建洲,蒋增海等 猪业科学)

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