摘要：冷冻造成精子的结构和功能变化是导致繁殖率低的根本原因。笔者通过对比试验，检测精液冷冻后对羊繁殖率的影响。用假阴道法采集3只～4只公羊精液，用Tris稀释液作为冷冻保存液，用TALP作为解冻液，比较精液冷冻前后活力；对同期发情处理的羊只进行鲜精和冻精人工授精，比较两者在受胎率上的变化。结果表明，冷冻前后精子活力分别为74.43%和46.25%，受胎率分别为83.33%和47.06%，说明超低温冷冻通过影响精子内部结构，显著降低了精子活力和受胎率。
精液冷冻是利用液氮（-196℃）等作为超低温冷冻源，将经过特殊处理的精液长期保存的一种方法，是人工授精的一项重大革新。超低温冷冻使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，最大限度地提高优良公畜的利用率，加速品种的育成和改良步伐。在现代养殖业中，精液冷冻不仅可以使优良基因得到无期限的保存，延长公畜使用年限，而且还可减少养殖企业成本，便于工厂化、规模化科学安排生产，提高养殖业生产效益。国内外精液冷冻技术取得了很大进展，但因冷冻易对精液造成诸如顶体受损、质膜破坏、畸形等物理变化，渗透压增高、细胞脱水等生理变化，从而影响受胎率，阻碍精液冷冻技术在养羊业中的发展。为了在长治市地区推广羊精液冷冻技术，扩大冻精使用率，提升冻精使用的知晓率，实验人员在当地对绵羊精液超低温冷冻后对繁殖率的影响进行了试验比较。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
精液来源于本场按种公羊标准饲养，身体健康的2岁～4岁公羊。受试母羊健康无病，经产2胎～3胎，经同期发情处理后随机组合进行冻精人工授精试验。所有羊只采取舍饲 + 放牧方式管理，自由采食青干草，自由饮水。精料主要由玉米、豆粕、麦麸配制而成。
1.1.2 主要仪器设备
TGL-16G高速台式离心机、光学显微镜、移液枪、恒温水浴锅。
1.2 方法
1.2.1 采精与精液冷冻处理
采用假阴道法操作程序采集3只～4只公羊精液，等量混合后用TALP液离心洗涤3次（1000r/min～1500r/min），每次 5min。将上述离心精液用高卵黄Tris 稀释液作为冷冻保存液，将精子密度稀释到为2×108/mL，平衡4h。平衡后，按每颗粒0.1mL的剂量在装有液氮的氟板上滴冻，放入液氮罐中贮存。
1.2.2 发情母羊的处理
选择受试母羊50只做同期发情处理，处理方法和药物使用参照张旭刚等试验方法进行。
1.2.3 冻精配种
取装有解冻液TALP的小试管，挑选大小均等的冻精颗粒，40℃水浴1min～2min，取1粒冻精颗粒迅速投入解冻液中溶解，镜检观察活率在40%以上的，进行输精配种试验，跟踪记录受胎率。
2 结果与分析
2.1 精子活力检查
检查鲜精和解冻后精子活力，结果见表1。经过冷冻后，冻精活力明显低于鲜精活力。说明冷冻一定程度上对精子形态结构造成了损害，降低了精子活力。
2.2 发情效果
观察和统计1个发情周期内羊只发情率。结果见表2。
经过PMSG处理后，羊只同期发情率为 81.39%。在羊只处理过程中，部分羊只植栓不到位，造成脱栓，降低了羊群整体发情率。
2.3 受胎率比较
鲜精和解冻后精子受胎率比较，结果见表3。冻精活力直接关系着受胎率。从表中可以看出，鲜精受胎率（83.33%）远远高于冻精（47.06%）。
3 讨论
精子成活率是受胎率的直接关系因素。在冷冻操作过程中，影响精子成活率的因素较多（如稀释液配制及倍数、精清过滤、冷冻速率快慢等）。多名研究人员采取了不同的方法，得到的结果十分接近。毛晓林等对安哥拉山羊进行的研究，其解冻后活率仅为0.36，情期受胎率则达到63.74%；赵晓娥等报道,应用细管保有存波尔山羊精液，其活率最高可达0.60；徐刚毅等、朱明齐等对波尔山羊冷冻精液进行解冻，其冻后活率仅为0.3～0.4左右。
3.1 稀释液
对精液进行适当稀释可以提高精子的成活率，也可扩大精液授精范围，而不同的稀释液对解冻后精子的活率影响也很大。当前，应用最广泛的精液稀释液是卵黄+Tris葡萄糖稀释液，它使精子能够很好地保存。徐振军等试验使用的葡萄糖稀释液和柠檬酸钠稀释液，使解冻后精子的活率保持在0.5以上，远高于对照组，这说明稀释液直接关系着精液冷冻解冻后精子的生存活率。精液稀释倍数对精子也存在不同的影响。稀释倍数过大，精子的存活率反而会随着稀释倍数的增加逐渐降低，最终影响受胎率。这可能是由于随着稀释倍数的增加，单位体积稀释液里的精子数量下降，导致受胎率降低。Sminov等研究证实稀释比例从5倍增加至11倍时产羔率下降。丁瑜等在实验中得出结论，绵羊最佳稀释比例为1∶3。
3.2 精清
冷冻过程会造成精子超微结构受损，出现顶体囊泡化（即假顶体反应）、线粒体尾部受损等一些可逆性损害。在未去除精清的情况下，这种伤害作用会同冷冻 - 解冻过程中的伤害作用结合，对精子的损伤更为严重。而去除精清则可降低这种伤害作用，使精子所受的冷冻损伤大为减轻。
3.3 冷冻
水在缓慢降温冷冻过程中易形成冰晶。精液中含有约 90%的自由水，精子中也含有少量水分，在精液冷冻过程中，缓慢降温极易引起精子细胞内外所发生一系列的理化变化。虽然冰晶引起精子损伤的机制还了解得很少，但比较明显的基本变化可归纳为单位膜完整性被冰晶破坏，细胞内外渗透压差增高，细胞脱水，进而精子形态发生改变，最终导致精子发生不可逆变化而死亡，降低精子存活率。
4 结论
经过几十年的发展，我国畜禽精液冷冻保存技术已经有了很大的发展，尤其是牛、羊冻精生产与应用已经很成熟，但冻精在养羊业中的应用目前还不是很普及，重要原因就是冻精受胎率仍远低于鲜精。
精液冷冻技术的研究还面临着诸如稀释液配制、解冻等一些技术瓶颈，冷冻仍然会对精子细微结构造成不可逆的变化，如单位膜完整性遭到破坏、细胞内外渗透压增高等，甚至可能存在精子蛋白质变性、氨基酸损失等情况，这些需要通过更深入的研究得以佐证。
总之，虽然以上这些因素造成冷冻精液解冻活力低、受胎率低，但随着新技术的发展，冻精在扩大畜禽养殖规模，会畜禽工厂化、规模化生产中必将发挥重要的作用。如何让冷冻对精子结构和功能的影响降到最低，减少低温冷冻对精子结构的破坏，采取科学的保护措施提高精子的成活率需要我们进一步研究论证。
（郭伟彪 山西省长治市郊区马厂畜牧兽医中心站；张旭刚 山西省长治市郊区堠北庄畜牧兽医中心站；李军 山西省长治市郊区老顶山畜牧兽医中心站）
