不同酶浓度对脱脂豆粕水解效果影响的研究

    [摘要] 本试验选用0、200、400、600、800、1000U/mL 6个浓度梯度的2709碱性蛋白酶水解脱脂豆粕，研究酶浓度对脱脂豆粕水解效果的影响。结果表明，随着酶浓度的增加，豆粕氮溶质数、酸溶性氮得率、豆粕蛋白水解度及水解液中氨基酸含量不断增大；豆粕蛋白得率呈显著降低趋势。综合各指标试验结果得出，利用2709碱性蛋白酶水解豆粕，适宜条件为pH9.8，酶浓度400U/mL，48.5℃，保温5h。

    研究表明，和游离氨基酸相比，机体对肽的吸收更迅速，利用率更高，大豆蛋白肽以其促生长、增强免疫的功能日益被人们重视。豆粕蛋白质含量丰富，价格低廉，是商业生产大豆蛋白肽的理想原料。本文通过研究不同酶浓度对豆粕水解效果的影响，进一步验证了利用2709碱性蛋白酶水解生产大豆蛋白肽的适宜条件，以期为酶水解豆粕的商业化生产提供资料参考。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    脱脂豆粕：河南正大畜禽有限公司，粗蛋白含量为44.1%，脂肪含量为1.2%，无霉变，干燥，粉碎至60目以上；2709地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶（100×104U/g）：邢台思倍特生物科技有限公司；蒸馏水；甲醛、盐酸、氢氧化钠等试验试剂均为分析纯。

    1.2 主要设备

    全自动凯氏定氮仪（KjeltecTM 2300）；恒温磁力搅拌器；离心机；水浴锅；电子分析天平；pH酸度计；匀浆机。

    1.3 测定指标及方法

    1.3.1 氮溶质数（Nsi）

    取一定量豆粕按1︰7.5比例加水（或酶液）维持pH =9.8，48.5℃下，保持5h 后过滤，少量水冲洗滤渣，合并滤液，加热到75℃，水浴锅保温1h，使酶失活，测定滤液含氮量并计算Nsi。

    1.3.2 酸溶性氮得率

    等电点滤液中可溶性氮与所加豆粕的总含氮量之比即为酸溶性氮得率。

    1.3.3 蛋白质水解度（DH）

    DH的定义是蛋白质水解过程中，被断裂的肽键数与给定蛋白的总肽键数之比，由下式计算得出：DH（%）=打断的肽键数目总的肽键数目×100

    1.3.4 水解液中氨基酸甲醛滴定法测定。

    1.3.5 蛋白得率

    调节滤液pH值在大豆蛋白质等电点（pH =4.5），使滤液蛋白质沉淀，计算沉淀蛋白量与加入的豆粕总蛋白量之比。

    1.4 酶处理步骤

    ⑴豆粕粉分别与不同质量的碱性蛋白酶按照1：7.5比例加水匀浆。

    ⑵滴加NaOH溶液，调节pH =9.8，盖上薄膜，调最适温度。

    ⑶固定时间调节pH ，保持溶液的碱度。试验开始每隔5min 滴定一次；半小时之后，每隔15min进行调节。每次记下消耗的碱量。试验过程中水位低于刻度线，加水补充。

    ⑷水解5h后迅速加热至75℃，恒温1h。

    ⑸冷置，200目过滤，冲洗，冲洗液进入滤液。

    ⑹将滤液1500r/min、离心10min，取上清液，250mL定容。得到滤液1。

    ⑺分别用甲醛法、凯氏定氮法测定滤液1中氨基酸的含量和氮溶质数。

    ⑻滴加硫酸调节pH至4.5，静置3h，4000r/min，离心10min，弃上清液，得蛋白质沉淀，烘干，称重。测定蛋白得率和酸溶性氮得率。

    2 结果与分析

    2.1 不同处理时间对豆粕DH的影响
    为了确定最佳的水解时间，我们首先选择200和400U/mL两种酶浓度，进行预试验。处理结果见图1。从图1可以看出，不论200U/mL还是400U/mL酶浓度水解豆粕蛋白质水解度都在处理5h左右趋于稳定，虽然随着处理时间的增加，DH值还有变化，但考虑到生产成本和效益，我们认为酶解豆粕的适宜时间为5h。

    2.2 不同浓度酶处理对豆粕氮溶质数的影响
    不同浓度酶处理对豆粕Nsi的影响见图2，从图2可以看出，pH =9.8，豆粕中不添加酶时，Nsi为55.18%，表明pH =9.8 的碱性条件有利于豆粕蛋白的水解。豆粕 Nsi随着水解蛋白酶浓度变化不断变化，当酶浓度从200U/mL升高到400U/mL时，豆粕Nsi也不断增大，但当酶浓度大于400U/mL时，豆粕Nsi增加幅度显著降低。因此，可以初步判定豆粕水解的适宜蛋白酶浓度为400U/mL。

    2.3 不同浓度酶处理对豆粕酸溶性氮得率的影响
    酸溶性氮得率是检验酶对蛋白水解能力的评估指标。由图3可知，随着酶浓度的增加，酸溶性氮得率也随之增大，但酶浓度大于200U/mL时上升幅度显著降低。当酶浓度为800U/mL时，酸溶性氮得率达到79.79%，绝大部分的蛋白质都变成了可溶性的蛋白降解物。

    2.4 不同浓度酶处理对豆粕水解液中氨基酸的影响
    测定水解液中氨基酸的量是选择合适水解程度的一个依据。豆粕中的蛋白质在水解时，可产生氨基酸和多肽，而多肽还可以进一步水解成氨基酸。2709碱性蛋白酶专一性很差，需要控制好试验条件才可以在减少水解液中氨基酸的同时，经济、高效地得到肽溶液。经过甲醛法测定，由图4可知，随着酶浓度的增加，水解液中氨基酸含量也随之增加，但酶浓度从200至800U/mL，氨基酸的量均小于大豆蛋白降解肽的质量指标中的相关规定（氨基酸氨占总氨的百分比≤12.6%）。

    2.5 不同浓度酶处理对豆粕产物蛋白得率的影响
    由图5可知，酶浓度为0时，豆粕水解产物的蛋白得率为40.21%，酶浓度为200U/mL粕中添加蛋白酶可减少豆粕水解产物中蛋白含量，促进豆粕水解。随着酶浓度的增加，虽然蛋白得率不断下降，但酶浓度大于200U/mL时下降幅度不大。

    3 讨论

    通过上述对水解反应中几项指标的研究，我们发现酶浓度超过400U/mL，生产性能没有显著的提高；在200U/mL与 400U/mL情况下，不仅生产性能相似，而且成本也是较低的。因为生产时酶有损耗，所以酶浓度为400U/mL是最符合生产实际的参数。表1是选择酶浓度为400U/mL时的几项试验数据，满足所需肽溶液营养需要。
    4 结论

    由试验结果可以得出，酶可以促进豆粕中蛋白的水解，当pH=9.8，2709碱性蛋白酶（100×104U/g），最适生产浓度为400U/mL，48.5℃保温5h时水解度为26.7%，水解液中含氮78%~80%；蛋白得率5.87%，酸溶性氮得率73.08%；游离氨基酸9.63%。

    （盛东峰  周口师范学院）