猪圆环病毒病 (PCVD)是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪传染性疾病，该病的主要特征为患猪体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难和母猪繁殖障碍。猪圆环病毒是目前发现的一种最小的哺乳动物病毒，包括两个血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2有致病性。现有6份临床症状疑似PCVD的病毒料，需要分离病毒，建立PCR及ELISA方法进行检测。
1 材料与方法
（1）试验材料。试验病料来自不同地区疑似被PCV2感染猪的肺、淋巴结和肝等器官的组织病料。试验试剂及主要仪器有胰酶、D-hanks液PCR扩增仪、低温高速离心机、台式离心机、电泳仪和凝胶成像系统。
（2）试验方法。细胞培养于37℃、5%CO2的环境中。细胞生长液为含8%血清的DMEM培养液，维持液为含4%的DMEM培养液。2天传代1次。将病料组织剪碎，用 Hanks液研磨并制成5～10倍乳悬液反复冻融，离心0.22μm 微孔过滤后-20℃保存。当细胞长满50%～70%左右，将处理好的病毒上清液滴入细胞瓶内，在 37℃、5%CO2培养半小时，倒掉病毒液，然后加入4%DMEM维持液。当细胞长满单层后，细胞传代方法操作换8%DMEM 维持液，盲传3代，未出现细胞病变。含有病毒液的细胞瓶存放于-20℃冰柜中，冻融3次后，收取病毒液密封冻存于-20℃备用。从病毒液上清中提取DNA，加入PCR反应体系中。体系为25μl。上游引物P1：5’-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’；下游引物P2：5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’；片段751bp。94℃ 3分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，循环35次。72℃最后延伸10分钟。
本实验按照参考文献的方法介绍，处理待测样品。用酶标仪在450nm处测OD值。
2 结果与分析
样品在1%琼脂糖凝胶电泳后，得到750bp左右的特异性核苷酸片段，与实验预期结果一致。实验病毒料的OD值与阴性样本的OD值之比为2：7，实验结果为阳性，与实验预期结果一致。
3 讨论
仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和多种疫病都与PCV2相关联。现在主要应用PCR等分子生物学方法诊断PCV2，因此对不同地区来源的PCV2毒株基因组序列确定其基因序列变异程度，可以为建立有效的PCV研究方法提供依据。PCV2单独感染时的症状和病变并无特征性，必须借助实验室手段才能进行确诊。
目前研究较多的实验室检测技术有间接免疫荧光(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、单克隆抗体以及多种聚合酶链式反应(PCR)技术等。与传统方法相比，PCR具有较高的敏感性和特异性，而且操作简便，是最常见的诊断方法。本实验的检测结果为阳性，初步鉴定该病毒为猪圆环病毒。但有关该病毒料的其他一些生物学特性尚待进一步鉴定。
（胡元春 河南省新乡市动物疫病预防控制中心）
