冯瑜菲 东北农业大学
2000 年，Notomi T 等发明了一种新颖的核酸等温扩增技术，即环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异性、高灵敏度的扩增靶序列。目前，该方法已在很多畜牧相关领域得到了广泛的应用，包括传染性疾病的诊断、病原微生物的检测、食品卫生检验及环境监测等。
1. LAMP 的引物设计
LAMP 反应是一种崭新的 DNA 扩增方法，针对靶序列的 6 个特异性区域设计 4 条特殊引物，利用 Bst DNA 聚合酶的链置换活性提供反应动力，在恒温条件下完成对靶基因的大量扩增。4 条引物中包括 2 条内引物和 2 条外引物。内引物 FIP（forward innerprime）包含 F1c 序列和 F2（F2c 区域的互补序列），BIP（backward inner primer）包含 B1c（B1 区域的互补序列）和 B2 序列。F1c 和 B1 为分别位于 F2c 和 B2 内侧，F2c 和 B2 为扩增片段两端长度为 18nt~24nt 的特异序列，F3c 和 B3 为分别位于 F2c 和 B2 外侧。扩增的靶序列的长度最好在 300bp 以内，超过 500bp 长度的序列扩增效率较低。
2 LAMP 的原理
LAMP 的反应温度为 60~65℃，该温度是 DNA 双链复性和延伸的中间温度，DNA 在此温度处于一种动态平衡状态，任何一条引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。LAMP 反应可分为三个阶段，即起始阶段、扩增循环阶段以及延伸和再循环阶段。
第一阶段：起始阶段。在链置换型 Bst DNA 聚合酶的作用下，以 FIP 引物 F2 区段的 3’末端为起点，与模板 DNA 互补序列配对，启动链置换 DNA 合成。F3 引物与 F2c 前端 F3c序列互补，以 3’末端为起点，通过链置换活性 DNA 聚合酶的作用，一边置换先头 FIP 引物合成的 DNA 链，一边合成自身 DNA，如此向前延伸。最终 F3 引物合成而得的 DNA 链与模板 DNA 形成双链。由 FIP 引物先合成的 DNA 链被 F3 引物进行链置换产生一单链，这条单链在 5’末端存在互补的 Flc 和 Fl 区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以 BIP 引物的 3’端为起点，合成互补链。在此过程中环状结构被打开。接着，与 F3 类似，B3 引物从 BIP 引物外侧插入，进行碱基配对，以 3’端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链 DNA。而被置换的单链DNA 两端均存在互补序列，自然发生自我碱基配对，分别形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状茎环结构，该结构是 LAMP 反应基因扩增循环的起始结构。
第二阶段：扩增循环阶段。首先在哑铃状茎环结构中，以 3’末端的 Fl 区段为起点，以自身为模板，进行 DNA 合成延伸。与此同时，FIP 引物 F2 与环上单链 F2c 杂交，启动新一轮链置换反应。解离由 Fl 区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式 B2c，BIP 引物上的 B2 与其杂交，启动新一轮扩增。
第三阶段：延伸和再循环阶段。在新一轮扩增启动后，经过相同的过程，又可形成环状结构。如此往复循环，形成一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构。通过此过程，同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。
此外，Notomi 等人通过设计的 Loop 引物（LF、LB）来进一步加快 LAMP 反应的效率。Loop 引物结合的区域在 F2 和 Fl 之间或是 B2 和 B1 之间，以 Fl 到 F2 的方向或是 Bl 到 B2的方向结合。Loop 引物通过与哑铃状茎环结构杂交，启动链置换 DNA 的合成。而已经和内引物 FIP 或 BIP 杂交的茎环则不能再与 Loop 引物杂交。这样，所有的茎环 DNA 或者与内引物杂交，或者与 Loop 引物杂交，从而加快了反应速度。经实验表明，使用 Loop 引物的 LAMP反应具有更高的敏感性，反应时间也可比原来的 LAMP 反应缩短近一半的时间。
