1 试验材料
1.1 病例来源
2013年10月，常州市武进区动物疫病预防控制中心接诊本市某猪场病例。
1.2 病料
取40日龄病死断奶仔猪的肺、脾和淋巴结。
1.3 引物
PRRSV特异性引物，HCV特异性引物，随机引物（100mmol/L）。
1.4 试剂
RNA提取试剂盒，双抗生理盐水（青霉素、链霉素各1000IU/ml），dNTP（100mmol/L），Taq（DNA聚合酶），AMV（反转录酶），RNA酶抑制剂（RNasei），ddH2O（双蒸水），5×AMVBuffer，10×TaqBuffer。
1.5 器械
玻璃研磨器，平皿，组织剪，超净工作台，酒精灯，可调微量移液枪和tip头，离心机，离心管，42℃水浴锅，PCR管，1.5ml指形管，冰箱，PCR仪，凝胶成像系统，电泳仪。
2 方法
2.1 病理剖检
剖检3头40日龄的病死仔猪。
2.2 RT-PCR试验
2.2.1 准备
将玻璃研磨器煮沸消毒15min。
2.2.2 研磨
在超净工作台上，将病料组织剪取3～5g，置于玻璃研磨器中，按1∶5体积加入双抗生理盐水，研磨成匀浆，37℃静置30min。
2.2.3 收取病毒原液
将匀浆倒入离心管中，3000rpm10min，收取上清液倒入离心管中再次离心（8000rpm10min）。
2.2.4 RNA提取
用RNA提取试剂盒提取组织总RNA。取上清250ml加入trizol试剂500μl，混匀放置10min；用1ml针筒，26-G号（直径4.5）针头抽吸匀浆液2次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5mlEppendorf管中；加入100μl氯仿/异戊醇（24∶1），剧烈震荡混匀30s；台式离心机上，12000rpm，室温离心5min；将上清液（约450ul）小心转移到无菌1.5mlRNase-free离心管里，加入150μl无水乙醇，混匀；将上述溶液全部转移到套放于2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm离心1min；小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450ulRPESolution，10000rpm，室温离心30s；重复上一步骤一次；小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10000rpm，室温离心15s；小心取出柱子，放入无菌Rnase-freed的1.5ml离心管中，在柱内膜的中央小心加入50μlDEPC-H2O，55℃～58℃放置2min（室温放置产率约低20%左右）；10000rpm，室温离心1min。收集管内的溶液为RNA样品，可立即使用或者-70℃保存。
2.2.5 反转录（RT）
将提取的总RNA进行反转录，具体操作步骤详见表1。将表格中的反应物加入PCR管中，然后放入42℃水浴锅（置90min）中，置（-20℃）保存备用。
2.2.6 PCR扩增
取反转录好的cDNA进行PCR扩增（primers为PRRSV特异性引物），扩增步骤详见表2。将表格中的系列反应物加入PCR管中，按照下述的反应条件进行扩增。
2.2.7 反应条件
从试验的第2步到第4步的3个环节需要进行30次循环，详见表3。
2.2.8 PCR扩增
取反转录好的cDNA进行PCR扩增（primers为HCV特异性引物），详见表4。将表格中的系列反应物加入PCR管中，按照下述的反应条件进行扩增。
2.2.9 反应条件
第2步到第4步的3个环节需要进行30次循环。PCR扩增的反应条件详见表5。
2.3 电泳
1%琼脂糖凝胶的配制（0.3g琼脂糖+30ml电泳缓冲液，微波炉煮沸3次冷却至60℃左右时，加入2.0μl溴化乙锭，混匀倒入模具中插入梳子）；待凝胶凝固后，拔出梳子，置电泳槽中；取PCR产物15μl加入6倍的loadingbuffer3μl混匀，加样；进行电泳（电压：80V维持50min）。
3 结果
3.1 病史及流行病学调查结果
断奶仔猪的发病日龄在25～90日龄之间，且发病率和死亡率都很高，其中，以50～90日龄仔猪发病率和死亡率最高，分别达到100%；有3头母猪（有高致病性蓝耳病免疫史）出现繁殖障碍性疾病；由于健康状况不稳定，该场还没有对苗猪群接种过PRRS疫苗。
3.2 剖检结果
表现为心肌变软，肺脏弥漫性出血，或心尖肉变；部分有肝出血，胆囊肿大；脾脏轻度肿大，有少量梗死；肾肿大，有大量出血点或先天性发育不良；全身淋巴结水肿或周边出血；1/3出现胃溃疡，腹部皮下水肿。
4 小结与讨论
（1）根据病史及流行病学调查、病理变化及实验室诊断结果阳性，可确诊断奶仔猪的死亡是PRRSV与HCV混合感染所致。
（2）该场在2次引进种母猪时，未采取任何关于PRRSV的相关检测；并且该批猪群也未接种过PRRS疫苗，仅对猪群接种了猪瘟、猪细小病毒病、伪狂犬病、流行性乙型脑炎等疾病疫苗，导致对PRRS的漏防，使PRRSV容易在猪群内部传播；所以由此可判定，该场断奶仔猪暴发PRRS的病原可能是由于从外地引进的种母猪带入的，这也是导致断奶仔猪暴发PRRS的根本原因。
（3）虽然该场对断奶仔猪接种过猪瘟灭活疫苗，但由于PRRSV可引起猪免疫抑制，当仔猪感染PRRSV后：一方面，造成断奶仔猪机体的免疫抑制，使哺乳仔猪在28日龄断乳即使注射猪瘟疫苗后，机体不能或很少对抗原产生免疫应答，导致猪瘟疫苗免疫失败，不能发挥保护作用，使得断奶仔猪缺乏猪瘟抗体保护，而感染猪瘟，使死亡率上升。另一方面，断奶仔猪感染PRRSV后机体抵抗力下降，也容易引起其他病原体的继发感染。由于PRRS对养猪业的危害巨大，所以应加强对该病的重视，免疫接种PRRS疫苗，采取科学有效的措施，以控制住PRRS在武进区的蔓延，以实现消灭该病为最终目的。
（常州市武进区动物疫病预防控制中心，王建，陈丹清；常州市武进区，蒋红红，周波）
