一、猪流行性腹泻病毒培养增殖研究
相对于其他冠状病毒，Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的细胞培养要求较高， 从Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ发现开始，很多研究人员尝试用不同的方法将Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ适应于细胞， 但用了近１ ０年的时间都没有取得成功， 这在一定程 度 上 制 约 了 Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ 研 究 进 程。１ ９ ８ ８年，Ｈ ｏ ｆ ｍ ａ ｎ ｎ等首次在培养基含胰酶的Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞上成功复制出Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ， 并认为胰酶对Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ纤突糖蛋白切割作用增强了病毒对 Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞的感染力， 此后该方法成为Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ培养的标准方法， 被广泛应用于病毒分离、 细胞培养和疫苗的研究中。虽然 Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞是目前用于分离培养Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的最佳细胞系， 中国学者也很早就在Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞上成功培养Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ， 但是其来源的差异、 毒株间的差异及培养条件对于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的分离培养影响很大， 不同学者所报道的方法在胰酶浓度、 培养时间等方面差距较大。李品齐等（ １ ９ ９ ７） 用含６ ０μｇ／ｍ Ｌ胰酶的培养液培养 Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞进行Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ传代适应， 在第３代就出现明显的Ｃ Ｐ Ｅ， 第５代毒价可达１ ０－７ ． ０／ ０ ． １ ｍ Ｌ。修金生等（ ２ ０ １ ２） 将胰酶浓度控制在６μｇ／ｍ Ｌ连续传５代而获得病毒。庄金秋等（ ２ ０ １ ３） 通过反复摸索优化条件建立了用含终浓度５ ０μｇ／ｍ Ｌ胰酶的培养液培养Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞进行Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ传代适应， 结果盲传至２ ０代以后Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ特征性Ｃ Ｐ Ｅ稳定出现， 培养到７ ２ｈ左右开始出现Ｃ Ｐ Ｅ， 细胞肿胀、 变圆、 颗粒变性， ９ ６ｈ以后８ ０％以上的细胞出现Ｃ Ｐ Ｅ， １ ２ ０ｈ内可收毒， 研究结果中对出现典型Ｃ Ｐ Ｅ的特征描述与 Ｋ ａ ｄ ｏ ｉ等（ ２ ０ ０ ２） 报道的Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ典型Ｃ Ｐ Ｅ基本一致。然而相对于其他冠状病毒， 国内所做的分离培养工作仍然不够， 依赖于胰酶的 Ｖ ｅ ｒ ｏ细胞培养Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ是目前主要方法， 但在很多细节上差别较大， 报道显示对病毒毒力有影响， 包括疫苗制备工艺中细胞的培养方法、 对疫苗效果影响的评价都有待于进一步的研究。
二、猪流行性腹泻病毒分子生物学研究
（1）ＰＥＤＶ基因组结构
猪流行性腹泻病毒是套式病毒目（ Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ） 冠状病毒科（ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉ－ｄａｅ） 冠状病毒亚科（ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｉｎａｎｅ） 甲型冠状病毒
属（ Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ） 的 成 员。病 毒 粒 子 略 呈 球形， 直径９０～１９０ｎ ｍ， 为有囊膜的单股正链ＲＮＡ病毒， 囊膜上有花瓣状纤突， 长１２～２４ｎｍ， 由核心向四周放射， 呈黄冠状。ＰＥＤＶ基因组全长２ ７０００～３３０００ｂ ｐ， 相对分子质量为６×１ ０６～８×１０６， 包括５ ′端非编码区、 ３ ′端非编码区及至少７个开放阅读框（ ＯＲＦ１ａ、 ＯＲＦ１ｂ、 ＯＲＦ２～６） 。其中位于５ ′端编码非结构蛋白的 Ｏ Ｒ Ｆ １ ａ和 Ｏ Ｒ Ｆ １ ｂ占据了ＰＥＤＶ基
因组全长的２／３，而３ ′端主要是编码纤突（Ｓ）蛋白（１５０～２２０ｋｕ） 、 小膜（ Ｅ） 蛋白（ ７ｋ ｕ） 、 膜（Ｍ） 蛋白（ ２ ０～３ ０ｋ ｕ） 和核衣壳（ Ｎ） 蛋白（ ５ ８ｋ ｕ） 的基因， 在Ｓ和Ｅ 基因之间还有编码非结构蛋白的Ｏ Ｒ Ｆ ３基因。
（2）Ｓ基因及蛋白功能特性
ＰＥＤＶ的Ｓ蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白， 位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，具有刺激机体产生中和抗体、 识别靶细胞、 促进病毒和细胞膜的融合等生物学作用（ Ｂ ａ ｅ等， ２ ０ ０ ３） 。Ｓ蛋白由１ ３ ８ ３个氨基酸（ ａ ａ） 构成， 包括１个信号肽（ １－２ ２ａ ａ） 、 １个大的胞外区、 １个跨膜区（ １ ３ ３ ４－１ ３ ５ ６ａ ａ） 和１个短的胞质尾区。Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ不能像其他冠状病毒一样切割成Ｓ １和Ｓ ２亚基， 根据其他冠状病毒Ｓ蛋白保守的基序可以将Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ蛋白人为划分为Ｓ １区（ １－７ ８ ９ａ ａ） 和Ｓ ２区（ ７９０－１３８３ａａ） 。Ｓ １区位于蛋白表面， 可识别受体并与宿主细胞的受体结合，介导中和抗体的产生， Ｃｈａｎｇ等根据Ｔ Ｇ Ｅ ＶＳ基因的中和表位区序列信息， 初步鉴定了Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ基因１个抗原表位区（ ４９９－６３８ａａ） ； Ｓ ２负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合。Ｓ １蛋白抗原位点的深入研究对该病毒的防制具有重要作用， 是近年来研究较多的蛋白结构， Ｃ ｒ ｕ ｚ等（ ２ ０ ０ ７） 利用噬菌体随机肽库，鉴定了ＰＥＤＶ Ｓ蛋白的１个模拟表位（ １３６８－１３７４ａａ） ； Ｓ ｕ ｎ等（ ２００８） 利用制备的６株ＰＥＤＶ Ｓ蛋白特异性单克隆抗体对构建的Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ １基因特异性肽库进行淘选， 并结合肽扫描技术， 最终鉴定２个中和表位（ ７４８－７５５和７６４－７７１ａａ） ， 为表位疫苗的研制奠定了基础。
Ｓ蛋白氨基酸序列有一接近９ ０个氨基酸残基链， Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ与犬冠状病毒、 猫传染性腹膜炎病毒、 猪传染 性 胃 肠 炎 病 毒 （ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｍ ｉ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｇ ａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｓｖ ｉ ｒ ｕ ｓ，Ｔ Ｇ Ｅ Ｖ） 和人冠状病毒２ ２ ９Ｅ仅有２个残基（ 即２ ． ２％） 保守， 其余序列（ 除Ｎ端２ ５ ０个残基外）则至少有２ ０％相同。这９ ０个氨基酸的序列区内所有的点突变都会使相关的单克隆抗体失效， 韩国全北国立大学报道了这９ ０个氨基酸残基链（ 命名为Ｋ － Ｃ Ｏ Ｅ） 的免疫介导功能， 并将其在没有尼古丁的烟草中表达， 表达产物饲喂小鼠， 结果小鼠产生了抗Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的 抗体。此外研究 发现， 氨基 肽 酶 （ ａ ｍ ｉ ｎ －ｏ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ Ｎ，Ａ Ｐ Ｎ） 是冠状病毒的感染受体， 属于Ⅰ群冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒、 人冠状病毒２ ２ ９ Ｅ、 猫冠状病毒等均以各自宿主的氨基肽酶作为细胞感染受体， Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ蛋白第２ ４ ９－５ ２ ９位氨基酸区域则是ｐ Ａ Ｐ Ｎ细胞受体的１个潜在的结合区域，但这方面的研究还很少， 有待于进一步的研究证实。Ｓ蛋白已被广泛用于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的分子诊断和抗体检测， 同时冠状病毒的变异主要集中在Ｓ蛋白上， Ｓ蛋白的变异将会导致其宿主范围、 组织细胞培养及毒力发生改变（ Ｋｗ ｏ ｎ等， １ ９ ９ ８） 。Ｋ ｕ ｃ ｈ ｅ ｌ等（ １ ９ ９ ２）从感 染 的 Ｖ ｅ ｒ ｏ细 胞 中 提 取 Ｓ、Ｎ 蛋 白；Ｈ ｏ ｕ等（ ２ ０ ０ ７） 利用大肠杆菌重组表达 Ｎ蛋白， 用于建立Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ抗 体 检 测 方 法；于 强 等 （ １ ９ ８ ７） 、韩 蓉 等（ ２ ０ １ ３） 用不同方法制备纯化的抗原， 用于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的抗体检测。Ｓ ｏ ｚ ｚ ｉ等（ ２ ０ １ ０） 利用单克隆抗体建立了检测Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的双抗体夹心Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ， 对临床感染的检测具有很重要的价值， 但同时也存在提高敏感性、 特异性等方面的问题。Ｐ ａ ｒ ｋ等（ ２ ０ ０ ７） 比较了４ ５个韩国分离株Ｓ基因上６ ５ １ｂ ｐ的基因片段， 结果显示核苷酸 相 似 性 在 ８ ８ ． ７％ ～９ ６ ． ７％ 之 间。 肖 贤 等（ ２ ０ １ ３） 克隆了上海地区２ ０ １ ２年流行毒Ｓ基因， 对序列测定分析认为， ２ ０ １ １年来中国流行的Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ存在异质性， 可分为２个类型（ Ｇ ｒ ｏ ｕ ｐⅠ和Ｇ ｒ ｏ ｕ ｐⅡ） ， 从Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ的报道来看， Ｇ ｒ ｏ ｕ ｐⅠ目前是主要流行毒，Ｇ ｒ ｏ ｕ ｐⅡ与传统毒株同源性较高， 福建等地均有同类报道。刘孝珍等（ ２ ０ １ ２） 对分离到的１ ７株Ｐ Ｅ Ｄ ＶＳ １基因进行了套式Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ扩增和序列测定， 遗传演化分析显示１ ７株病毒在Ｓ １不同位点发生了不同程度的变异， 有７个属于Ｐ Ｅ Ｄ ＶⅠ群， １ ０个属于Ｐ Ｅ Ｄ ＶⅢ群， 同时发现独立于其他群的新的基因型，有待于进一步研究。郑逢梅等（ ２ ０ １ ３） 在分析Ｐ Ｅ Ｄ ＶＳ、 Ｍ 和Ｏ Ｒ Ｆ ３基因序列演化的基础上， 对Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的变异情况进行分析和预测， 结果发现与Ｃ Ｖ ７ ７ ７株相比， 华中地区分离株的Ｓ基因有１ ９ ８ｂ ｐ发生突变，推导出８ ４个氨基酸发生突变， 主要发生在Ｓ １区域，分析抗原位点的改变主要集中在Ｓ １区， Ｓ基因的遗传进化分析和基于Ｓ １区的基本一致。有研究结果表明， 感染Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ猪的血清中， 抗Ｓ蛋白的抗体比抗Ｎ蛋白的抗体更为持久， 可在更长的时间内检测到抗Ｓ蛋白的抗体（ Ｒ ｏ ｄ á ｋ等， ２ ０ ０ ５） ， 由此可见， Ｓ蛋白的研究在Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ流行的检测、 变异毒株鉴定、抗原位点及疫苗研究意义重大， 但这方面的研究还不系统， 有效利用于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的致病机理、 疫苗研究还有很多工作要做。
（3） Ｍ基因及蛋白功能
由 ＭＲ ＮＡ ５编码的 Ｍ蛋白是Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的一种穿膜蛋白， 该蛋白对病毒的组装及成熟出芽过程中起重要作用， 同时也是病毒刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白， 其抗原表位在疫苗的研发和新型检测方法的建立具有极大的应用前景。有研究将Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的Ｅ和Ｍ 基因导入甲病毒载体中， 在ＢＨＫ ２ ２ １细胞中得到了成功表达， 为进一步探讨Ｅ和 Ｍ 蛋白在抗病毒中的作用奠定基础。蒋梅等（ ２ ０ １ ３） 对 Ｍ 蛋白截段基因克隆后进行测序， 结果显示该基因长６ ６ ４ｂ ｐ， 编码２ ２ １个氨基酸； 用Ｄ ＮＡ Ｓ ｔ ａ ｒ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｎ模块对该基因编码的蛋白进行主要的抗原指数、 二级结构、 蛋白质骨架柔性、表面可及性等参数进行预测， 并在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区， 确定该截段基因的Ｂ细胞抗原优势表位可能分布。另外研究发现在补体存在的条件下， 抗 Ｍ蛋白的单克隆抗体能中和病毒的感染性；同时还发现 Ｍ蛋白能介导机体产生ɑ干扰素（ Ｙ ｏ ｏ等， ２ ０ ０ ３； Ｌ ａ ｕ ｄ ｅ等， １ ９ ９ ２） ， 因此利用 Ｍ 蛋白在体液免疫中的机理， 用于开发Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ基因工程疫苗， 具有广阔的前景。
（4）Ｎ 基因蛋白功能
Ｎ蛋白是一种磷酸化的并富含碱性氨基酸的结构蛋白， 有６～７个潜在的磷酸化位点， ３个相对保守的结构域， 位于中间的１个结构域能够与病毒的Ｒ ＮＡ前导序列结合， 与病毒基因组Ｒ ＮＡ相互缠绕形成核衣壳。研究发现， 在宿主细胞的细胞核中也可以发现病毒的Ｎ蛋白， 这表明Ｎ蛋白中存在引导蛋白到细胞核中定位的信号， Ｎ蛋白借助这些信号和载体蛋白相互作用从而进入细胞核， 参与细胞核仁的功能调节， 干扰宿主细胞的周期， 从而为病毒的复制提供条件（ Ｓ ｕ ｒ ｊ ｉ ｔ等，２ ０ ０ ８） 。刘随新等（ ２ ０ １ ３） 构建核仁定位信号缺失重组质粒ｐ Ａ ｃ －Ｇ Ｆ Ｐ ｄ Ｎ， 转染Ｖ ｅ ｒ ｏ Ｅ ６细胞， 利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察核仁定位信号缺失的Ｎ蛋白的定位情况和转染细胞的周期变化， 结果发现， 与完整的 Ｎ蛋白相比， 缺失核仁定位信号的Ｎ蛋白不能定位于细胞核仁， 同时丧失了使宿主细胞周期在Ｇ ２ ／Ｍ期停滞的能力， 从而揭示了Ｎ蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响， 进而为Ｎ蛋白核仁定位信号对宿主细胞的影响提供了试验依据， 为进一步研究Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的致病机制奠定了基础， 同时对核仁定位信号的初步分析为Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ致病机制的阐明和基因疫苗的研制提供了新的依据。Ｃ ｈ ｅ ｎ等（ ２ ０ ０ ２） 通过研究推断人呼吸系统冠状病毒（ Ｓ ＡＲ Ｓ － Ｃ ｏ Ｖ）Ｎ蛋白与核仁蛋白和纤维蛋白相互作用， 使其重新分布， 并抑制细胞的分裂；Ｗｕ ｒ ｍ等（ ２ ０ ０ １） 也认为鼠肝炎病毒和猪传染性胃肠炎病毒Ｎ蛋白可能延迟细胞周期来创造有利病毒复制的适宜条件。在感染病毒的细胞中， Ｎ蛋白是表达量最高的病毒蛋白之一（ Ｃ ａ ｌ ｖ ｏ等， ２ ０ ０ ５） ， 猪在感染Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的早期，体内就能产生抗 Ｎ 蛋 白 的 高水平 抗体（ Ｊ ｉ ｎ ｇ ｈ ｕ ｉ等， ２ ０ ０ ５） ， Ｌ ｅ ｅ等（ ２ ０ １ ０） 通过Ｐ Ｃ Ｒ －Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ技术分析 了１ ３株 韩 国 分 离 株 和 疫 苗 株Ｊ － ｖ ａ ｃ及Ｃ Ｖ ７ ７ ７的Ｎ 蛋白基因， 发现其中１ １个分离株与疫苗株在Ａ ｓ ｐ Ｌ ＥⅠ、 Ｈｇ ａⅠ和 Ｍ ｓ ｐＲ ９Ⅰ限制性酶切位点处有差异， 所以利用Ｎ蛋白来建立Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ诊断技术， 对Ｎ 基因进行Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ区分疫苗株和野毒株具有实际临床研究价值， 开发实用型检测产品有很要的必要性。
（5）ＯＲＦ３基因
由ＯＲＦ３基因编码的非结构蛋白（ ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＳＰ） 与其致病性关系密切， 通过在细胞上连续传代发现， 高度适应细胞的Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｏ Ｒ Ｆ ３发生了变异， 且毒力减弱（ 刘随新等，２ ０ １ ３） ， 这在其他 冠状 病毒 上 也 有出现。Ｓ ｏ ｎ ｇ等（ ２ ０ ０ ３） 通过Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ技术分析了Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的细胞致弱毒株和地方分离株的 Ｏ Ｒ Ｆ ３， 发现适应细胞的毒株在Ｈ ｉ ｎ ｄⅢ和Ｘ ｈ ｏ Ⅱ限制性酶切位点处发生了变化， 该位点的差异可用于区分Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ细胞适应株和野毒株， 用于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ感染的流行病学研究。对冠状病毒Ｎ Ｐ Ｓ １功能研究发现，Ｓ Ｐ １具有抑制宿主蛋白合成等功能， Ｓ ＡＲ Ｓ － Ｃ ｏ Ｖ的 Ｎ Ｓ Ｐ １可通过结合在宿主４ ０ Ｓ核糖体上来抑制宿主基因的表达， 但目前没有查阅到关于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ编码的 Ｎ Ｓ Ｐ １生物学功能的报道。
虽然对于Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ不同毒株 Ｍ、 Ｓ及Ｎ蛋白序列变化及进化分析的研究开展了一些工作， 国内外很多学者利用分子学研究建立了各种Ｐ Ｃ Ｒ检测方法，也用不 同方 法 纯 化 的 蛋白或单 克 隆 抗 体 建 立 了Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测方法， 然而到目前为止， 各位学者对结构蛋白的研究仍局限于实验室阶段， 有效利用于临床、 建立快速、 高效的检测办法还不成熟， 还没有商品化的抗体检测试剂盒和抗原检测试剂盒可供临床使用， 抗原纯化、 特异性、 敏感性等方面的研究需要加强， 随着正在研制的活疫苗投入临床中， 区分野毒和疫苗毒的抗原检测、 抗体检测难度将加大， 这些问题为Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ的有效防控提出了更高的要求。
