断奶仔猪尽管处于高速生长的阶段，但往往会因肠道功能发育不全和内生态环境紊乱陷入亚健康危机[1]。仔猪肠道不仅具有消化和吸收营养物质的功能，作为分泌和免疫器官，还能将机体内环境与细菌及毒素隔绝，因此肠道健康对仔猪健康养殖至关重要[2]。而断奶应激刺激肠道干细胞快速分化和增殖，以适应断奶引起的变化。然而，分化过程的加速可能导致未成熟肠上皮细胞和杯状细胞比例的增加，主要表现为隐窝深度加深和肠绒毛高度降低，影响肠通透性，降低肠道对毒素和病原体的屏障功能[3]。饲料端禁抗之后，仔猪肠道病原微生物的失控促使疾病频发、免疫应激、屏障功能损伤等问题日益严峻，说明肠道发育的机制是调控肠上皮细胞发育的关键[4]。因此，文章系统综述了猪肠道发育进程的最新研究方法，以期进一步推动无抗养殖技术的开发与应用，为我国生猪产业安全、高效、高质量的健康发展提供参考。
1 猪肠道研究模型
传统的肠道模型虽然可以在完整动物中或离体研究中进行评估，但成本高昂且劳动强度大。为了更高效研究猪肠道发育和营养调控，研究者通过培养细胞和类器官等方便、经济、易操作的体外模型阐明其作用机制[5]。
1.1 肠道上皮细胞
猪肠道是由从胃到肛门的连续消化道组成，其中肠壁由内至外分别是黏膜层（上皮层）、黏膜下层、固有肌层和浆膜层。肠上皮由大量重复自我更新的隐窝-绒毛轴（crypt-villus axis, CVA）单位组成，其中绒毛延伸出肠腔，隐窝内陷到下层间质[6]。肠道上皮细胞（intestinal epithelial cells, IEC）分为吸收型细胞和分泌型细胞，包括肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、簇细胞、肠内分泌细胞和微皱褶细胞等，具有营养消化吸收、屏障功能、免疫功能、生物节律等功能[7]。隐窝中有肠干细胞和转运扩增细胞，隐窝底部的肠道干细胞（intestinal stem cells, ISC）严格调控着肠道的发育，IEC发育过程中，肠道由空泡状胎儿型上皮细胞（形成球形胎儿型类器官）逐步分化为成年上皮细胞（形成花瓣状成年型类器官）[8]。仔猪肠道上皮发育过程伴随消化吸收方式的变化，空泡状胎儿型干细胞内含有大量溶酶体，通过胞吞作用吸收蛋白质，通过空泡内部溶酶体消化成小肽或氨基酸，从而实现细胞内消化，而成年上皮细胞逐步向细胞外消化转变，此时氨基酸转运载体显著高于胎儿型上皮细胞[9]。
IEC作为肠道免疫防御系统的第一道防线，在抵抗肠道病原菌感染过程中发挥了重要作用，营养感知信号与宿主防御功能在IEC中相互协调具有重要的生物学意义[10]。例如，断奶仔猪IEC膜蛋白糖基化水平降低，肠道花生四烯酸、精氨酸和天冬氨酸等代谢通路的相关基因或蛋白质发生显著变化[11]。此外，随着肠道隐窝-绒毛轴上皮细胞的分化成熟，负责营养物质消化吸收的蛋白质在隐窝-绒毛轴上呈现独特的表达模式，而细胞骨架等蛋白质随分化表达上调；mTOR信号通路相关蛋白的表达和细胞抗氧化能力表达下调[12]。
1.2 肠道类器官
传统消化道模型存在难以满足猪精准营养需求研究；而动物模型具有可操作性差、重复性低、菌群易感性高的局限性；肠道细胞系可用的不多，无法重现隐窝-绒毛结构，因此类器官是体外模拟肠道上皮结构和功能的最佳模型。肠道类器官（intestinal organoid, IO），又称迷你肠（mini-gut），是由离体的ISC和隐窝在适量的生长因子介导下，在基质胶中经由3D培养模式形成具有完整肠道组织的结构，近年来被用作肠道上皮细胞更新和发育及调控的体外模型[13]。研究发现，这些IO含有所有种类的肠上皮功能细胞，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和Lgr5+干细胞。IO含有多个隐窝结构，并相互连接形成中间有肠腔的迷你肠。猪IO体外模型的建立突破从以往研究中仅能观察表型的局限性，拓展到功能细胞单位层次，为更好地揭示环境因子与猪肠道互作机制奠定了基础[14]。
迷你肠研究的新方法包括肠道芯片和悬滴培养体系。通过“单肠道类器官微流控芯片”可为IO单颗粒实时示踪提供稳定平台，实现高通量筛选能促进肠道上皮细胞发育的营养物质[15]。该芯片采用截面型微流控芯片模具设计，在上皮通道之上和血管通道之下含有多孔柔性聚二甲基硅氧烷薄膜，通过精准进样及液体循环控制模块、片上实时电化学监测模块和荧光标志粉实时图像捕捉模块对单病毒实时示踪和肠道屏障功能实时监测[16]。在悬滴培养体系中，将IO重悬于特质的培养基中，然后将细胞悬液分装于96孔Perfecta 3D悬滴板中培养。悬滴系统需要的培养基更少，具有更快的细胞接种过程，同时规避不同批次培养基的异质性所造成的实验误差[17]。
2 猪肠道研究技术
研究肠道发育和健康的主要技术手段主要包括生化分析及技术分子生物学技术、细胞培养（细胞系、原代、类器官等）、同位素标记及高通量组学（转录组、蛋白质组、代谢组学、单细胞测序等）、生物信息学关联分析等[18]。
2.1 生化分析及分子生物学技术
生化分析及分子生物学技术是肠道上皮细胞研究的基本技术手段，常用的包括生理生化指标检测、凝胶电泳分子杂交、PCR技术、DNA物理图谱、DNA序列测定以及基因芯片、基因敲除等。例如，在百草枯诱导的肠道氧化应激体内外模型中，抑制敲除肠髓样分化因子88（MyD88）基因可缓解氧化应激诱导的肠上皮细胞的细胞凋亡、周期阻滞、DNA损伤和线粒体功能障碍，其机制是通过调控mTOR-p53通路促进自噬，进而减少活性氧的积累。该研究广泛应用现代生化分析及分子生物学技术，揭示了MyD88调节肠道氧化应激的重要作用，为营养调控仔猪肠道氧化损伤提供了潜在靶点[19]。
2.2 高通量组学
IEC增殖、分化和凋亡在肠道发育和稳态中起着重要作用，这种协调需要大量而即时的信号通路的干预，IEC增殖与凋亡平衡的紊乱可能导致各类肠道疾病产生[20]。miRNAs在肠道上皮的生长性能，肠道形态，营养吸收和屏障功能中起着至关重要的作用，如miRNA-29，它靶向NF-κB抑制因子和claudin 1，以增加肠通透性[21]。为了鉴定调控IEC更新的miRNAs，Zou等[22]对绒毛上细胞（F1）和隐窝细胞（F3）进行了高通量测序，结果表明miRNA-100可促进猪肠上皮细胞的分化和凋亡，抑制肠上皮细胞的增殖和迁移。
2.3 生物信息学关联分析
肠道微生物组是一个复杂的微生物生态系统，不仅影响日粮的消化和营养物质的吸收，其活动和相互关系对仔猪肠道健康至关重要。仔猪断奶应激往往导致肠道菌群紊乱，使得免疫功能缺失和疾病易感性进一步增加[23]。Bai等[24]基于Miseq测序仅在各个分类水平上进行群落结构的统计分析，发现饲粮中添加0.2%~0.8%的牡丹皮可改善断奶仔猪肠道菌群，包括提高微生物丰富度，增加厚壁菌门和乳酸菌属的丰度，这些菌属可能与提高营养吸收水平和肠黏膜免疫相关；以及降低拟杆菌属和肠球菌属的丰度，这些菌属可能与溃疡性结肠炎、结直肠癌等胃肠疾病相关。
3 猪肠道发育影响因素
3.1 遗传因素
遗传因素是影响猪肠道发育的主要因素，阐明其机制和规律是寻求调控手段的先决条件。猪小肠长度与平均日增重及平均日采食量显著正相关，因此可以通过调控仔猪ISC增加仔猪小肠长度来改善生长性能[25]。地方猪和外来猪肠道上皮发育往往存在显著差异。大白猪在小肠长度和小肠长度指数（长度/体重）显著高于地方猪种沙子岭猪，但是沙子岭猪在绒毛高度和黏膜消化酶活性及转运载体表达上显著高于大白猪，可能地方猪和外来猪在肠道营养消化吸收上采取了不同的适应机制[26]。尽管小肠长度是一个高营养代谢器官，随着长度的增加，其营养消耗也增加，但是总体上调控肠道发育还是可以改善日增重和采食量。
3.2 代谢因素
由于门静脉引流的内脏（肠、胰腺、脾和胃）仅占体重的5%，却占全身能量消耗的约30%，并且肠道的能量利用率较高，故了解哺乳期间IEC能量代谢变化对调控新生仔猪肠黏膜发育具有重要意义[27]。细胞分化过程中，对营养物质的消化和吸收相关蛋白质的表达上调；结构和酶调节的蛋白质表达显著下调，从7、14、21日龄仔猪空肠中段分离出隐窝细胞，利用同位素标记进行相对和绝对定量分析蛋白质合成，结果表明哺乳期仔猪肠道隐窝上皮细胞的能量代谢发生了变化，这种代谢模式因葡萄糖、脂肪酸和氨基酸（涉及糖酵解和柠檬酸循环代谢相关蛋白的产量）而异[28]。此外，断奶仔猪对饲粮粗蛋白（CP）水平极为敏感，肠道中消化不良的高水平CP会促进致病菌的产生，增加消化系统疾病的风险，低蛋白日粮添加维生素B6可能通过调节氨基酸代谢影响肠道健康[29]。
3.3 应激因素
肠上皮依赖于复杂的蛋白质混合物在不同的细胞间连接成屏障，肠黏膜的修复是上皮完整性和连续性的快速重建，包括邻近损伤表面的上皮细胞迁移到损伤表面。氧化应激诱导黏膜细胞有效能量的供应不足，不能维持正常的更新及损伤修复，从而抑制仔猪生长潜力的完全发挥[30]。哺乳期仔猪小肠细胞增殖、AKP活性和细胞间连接蛋白表达量随日龄逐渐增加。断奶14日龄血浆D-乳酸含量和小肠Kv通道表达增加，绒毛高度/隐窝深度、细胞增殖、AKP活性和小肠细胞间连接蛋白表达降低。黏膜细胞增殖分化从出生至21日龄逐渐升高；早期断奶后黏膜损伤在第3天至第5天最为严重，随后逐渐恢复[31]。细胞自噬是细胞反应中氧化还原信号的一个主要传感器，在缓解机体氧化应激反应中发挥重要作用。氧化应激状态下，活性氧（ROS）能通过自噬形成过程中的各种通路诱导自噬的产生。研究表明，呕吐毒素（DON）诱导自噬缺失细胞ROS水平升高，导致细胞死亡，ER折叠蛋白表达降低导致细胞应激反应失败。自噬通过IKK通路缓解氧化应激保护肠上皮细胞免受呕吐毒素DON的毒害作用，利用CRISPR-Cas9技术敲除猪肠上皮细胞中的Atg5（诱导自噬缺失），DON诱导正常细胞自噬，不会诱导Atg5-/-细胞自噬[32]。
4 猪肠道发育营养调控
早期断奶时肠道适应期所进行的各种适应性改变的最终结果就是肠道成熟。肠道成熟的实质是肠道重建，即由新分化的具有成熟功能的肠细胞逐步替代原有肠细胞的过程。小肠的功能单位是绒毛，小肠绒毛结构的变化的根本原因是黏膜细胞的有效能量的供给不足，必然导致肠细胞内源性“饥饿”，细胞不能获得进行多种生理活动所需的能量，导致小肠黏膜的形态、结构异常，绒毛变短，隐窝变深[33]。我们通过营养手段来调节断奶应激造成的肠道损伤。包括从营养水平、基因转录调控（DNA甲基化、染色质开放型、组蛋白修饰、转录因子）、微生物菌群-上皮细胞-免疫细胞互作等方面干预肠上皮细胞更新机制和肠道营养素吸收代谢规律，从而实现仔猪肠道健康和生长性能提升。
氨基酸而非血糖是小肠黏膜的主要能量来源，肠道细胞利用谷氨酰胺的基础代谢和ATP生成均高于葡萄糖，验证了肠上皮细胞优先利用谷氨酰胺作为能量来源的结论。Qi等[34]发现在正常能量供应下，谷氨酰胺、谷氨酸和Asp可以通过补充Krebs循环恢复小肠能量稳态，下调AMPK通路。然而,当仔猪处于低能量供应下，Gln、Glu和Asp不足以维持肠道能量平衡，此时机体会激活AMPK信号通路、脂肪酸的beta氧化及线粒体生物合成途径以满足仔猪肠上皮细胞的高能量需求，维持肠道黏膜能量稳态。
多胺作为肠道的“成熟因子”，在幼龄动物的消化生理、营养代谢以及正常生长中发挥重要的生物学作用[35]。但是在新生仔猪肠道中，精氨酸酶活性很低，而脯氨酸氧化酶活性极高，所以在新生仔猪肠道中多胺的合成并不以精氨酸为主，而以脯氨酸为主。哺乳期仔猪灌喂腐胺及脯氨酸显著提高了断奶仔猪空肠PCNA阳性细胞率，有效地增加了空肠隐窝细胞的增殖能力；并且，脯氨酸提高了空肠碱性磷酸酶活性，促进了空肠细胞的分化[36]。维生素A（VA）通过影响仔猪ISC干预肠道发育和消化吸收功能，进而调控仔猪生长性能。与对照组相比，仔猪平均日增重和饲料转化率在第8~14天显著增加，这可能与肠道分化相关的Lgr5+基因丰度显著升高有关[37]。
日粮中铁营养影响杯状细胞的分化和功能，缺铁显著抑制仔猪肠道上皮发育成熟。中/高浓度铁状态下的结肠杯状细胞数量显著高于低铁状态。缺铁抑制仔猪肠道上皮发育主要表现为肠道器官指数（长度和重量）和形态结构（绒毛高度和隐窝深度、绒毛表面积）显著降低；空泡状胎儿型上皮细胞增多，成年型上皮细胞标志基因表达降低[38]。而甘氨酸螯合铁（FebisGly）通过调控APMK/FOXO通路提高肠道抗氧化能力，增加仔猪肠道GSH水平，降低肠道MDA水平，通过增加结肠厚壁菌属丰度、降低梭菌属丰度，影响肠道次级胆汁酸组成和代谢[39]。相似地，铜（Cu）是动物生长所必需的微量元素，断奶期饲粮中添加硫酸铜（CuSO4）改善了育肥猪的肠道形态，这可能是通过促进细胞增殖和提高ISC活性来实现的[40]。
自噬通过分解代谢回收细胞成分和受损的细胞器，以应对营养剥夺、病毒感染和基因毒性应激等逆境，自噬修饰剂常用于体内外调控这一过程[41]。Nalbandian等[41]发现在仔猪断奶的背景下，自噬修饰剂氯喹（CQ）和雷帕霉素（RAPA）呈现出不同的效果，前者CQ通过在溶酶体中酸化和干扰液泡H+ATP酶来逆转自噬，灌服CQ后能部分抑制肠道细胞自噬，缓解仔猪断奶过程的生长抑制作用以及改善肠黏膜形态结构，而后者RAPA是mTOR信号通路机制靶点的特异性抑制剂，则加剧了断奶引起的肠黏膜形态损伤。
以植物提取物为主的天然产物是保持肠道健康的新趋势。鞣花酸（EA）是分布于石榴等众多水果或坚果中的天然多酚类抗氧化剂。EA缓解了氧化应激引起的断奶仔猪生长停滞，激活氧化应激仔猪肠道Nrf2信号通路来改善黏膜屏障功能和提高紧密连接蛋白的表达，从而促进仔猪肠道溶酶菌和免疫球蛋白A的分泌[42]。在与之相关的试验中，50 mg/kg和100 mg/kg EA显著提高了百草枯染毒过程中与Nrf2/Keap1信号通路激活相关的抗氧化酶的活性，并且增加盲肠L. amylovorus和L. reuteri的相对丰度，有效地改善了百草枯诱导的肝脏氧化和炎症损伤，重塑肠道微生物结构与多样性[43]。微囊植物精油、普通精油、金霉素对断奶仔猪盲肠、结肠微生物β多样性的影响。低剂量微囊精油（100 mg/kg）可显著降低盲肠和结肠中潜在致病菌/有益菌的比值，效果优于普通精油。抗生素会升高结肠潜在致病菌/有益菌的比值。
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肠道是最重要的营养吸收和代谢场所，只有保证肠道的健康发育，才能保证畜牧产业的平稳可持续良性发展，为我国的助农富农推进乡村振兴添砖加瓦。本文综述了近几年仔猪肠道发育与营养调控应用的研究进展，从基因、蛋白质和代谢物层面系统揭示了断奶仔猪肠上皮细胞隐窝-绒毛轴结构发育和分化特性以及断奶后肠道的适应性变化规律，阐明了众多替抗产品等对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响和作用机制。
参考文献及更多内容详见：
饲料工业，2023，44（2）：1-6
