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熊兵成:浅淡非洲猪瘟

发布时间:2023-03-01 10:42    作者:熊兵成    来源:牧通人才网    查看:
    本文作者:熊兵成,18171955778

    男,汉族,1966年2月生,湖北天门人,1994至1999罗牛山桂林洋猪场饲养员,技术员,副场长,1999至2003浙江方立岭猪场场长,2003至2012年5月四川五丁集团养猪技术部经理(技术总监),09年访问学者到韩国金浦短暂学习(金浦是首尔的猪肉供应基地)发表论文多篇,其间新希望广汉事业部授课,培训多名场长,配种员。2012年至2018年6月自主创业基础母猪450头,循环生产年出售商品猪1.1万头,因环保猪场离天南长渠不足200米拆掉,2019年2月入职某邦湖北战区门湖5000头母猪场长,批次化生产,年供应商品猪12万头,全程料肉比(母猪料平摊育成猪上)3.0:1。本人在集团管理框架下,注重生产一线宏观统筹,微观细化,注重团队建设,培养员工认知,判断,决策,处置,驱动能力。2022年3月入职新希望六和。


    非洲猪瘟1921年在非洲肯尼亚首次发现,同年蔓延非洲东,南七个国家,1950年传入西非,1957年欧洲,1971年古巴,随后南美洲大部分国家暴发疫情,2007年传入高加索地区,2012年乌克兰,2013年白俄罗斯,2014年波兰,拉脱维亚,爱沙尼亚,2017年传入捷克,罗马尼亚,2018年8月传入我国(我国境内的非洲猪瘟属基因ll型,与格鲁吉亚,俄罗斯,波兰公布的毒株全基因序列同源性高度重合),给我国养猪事业带来很大的冲击,很多养猪企业或散户永远留在了黎明前,有的企业,特别是养猪大财团看到非洲猪瘟带来市场红利(我国每年需消费6.5亿头商品猪,市值规模1.2万亿左右,2019年市值规模1.6万亿多,2020年生猪出栏5.4亿头,市值规模2.3万亿)猪企纷纷硬件升级,把生物安全作为第一大工具 当它得到精细实施和制度执行时,猪企越来越有能力将ASFV控制在门外。

    ASF的特点  

    非洲猪瘟是家猪,疣猪,野猪的一种传染性极强的出血性疾病,所有年龄段的猪易感,不传染人。

    可表现为特急性,急性,亚急性,慢性四种形式。严重程度与毒株,猪种及流行时间的长短有关,急性型以高烧,食欲废绝,皮肤发绀,网状内皮系统出血为特征,发病2到10天内死亡,病死率高达100%,亚急性,慢性死亡率70%左右。临床上,与古典猪瘟非常相似。

    非洲猪瘟的病原学特性:

    (1)基本属性

    非洲猪瘟属于非洲猪瘟病毒属,非洲猪瘟病毒科,组成结构十分复杂一大基因组双股DNA囊膜病毒,类似痘病毒和疱疹病毒,具痘病毒的某些特性。

    (2)型态结构

    非洲猪瘟有5层,外膜(脂质层),衣壳,双层内膜,核心壳层和基因组。结构特征,包含3万余个蛋白亚基组装成直径为200nm(1纳米相当4倍原子大小,约相当于头发直径的一万分之一)的球形颗粒,是目前原子分辨率结构得到解析的最大病毒颗粒。

    非洲猪瘟病毒是一种有囊膜,单分子线状双股DNA病毒,二十面体对称,六角形外观,复杂多层结构,外被囊膜,内有核衣壳,中部为高电子密度核心,直径约80nm,核心外围包裹由P37,P34,P150等多种蛋白组成的核心衣壳,其外侧是源自内质网的内囊膜和围绕在内囊膜周围的病毒衣壳。

    (3)基因组结构

    ASFV是唯一己知核酸为DNA的虫媒病毒,只有一个血清型,可分24个基因型,ASFV基因组末端共价闭合,呈发卡结构,含有反向重复序列以及早期合成所必需的酶,整个基因组长度约170—192Kb(即千碱基:指某段DNA分子中含有一千个碱基),整个基因组有150—167个开放阅读框(ORF)其编码的蛋白中有131种病毒蛋白的结构和功能(以有报道)。

    (4)主要基因及表达蛋白

    病毒主要由蛋白质和核酸组成,病毒的大多数功能由蛋白质直接行使ASFV有超过50个结构蛋白,行使各种各样的功能,包括病毒形态的维持,病毒吸附与入侵宿主细胞,病毒的复制,病毒对宿主细胞代谢的调控,免疫逃避等,ASFV为双囊膜病毒,病毒粒子由内而外的组成依次是类核,内核芯壳,内囊膜,核衣壳和外襄膜。

    表达蛋白:CD2V外囊膜蛋白,分子质量大小105KU(K表示千,U为原子质量单位),CD2V蛋白表达后以跨膜蛋白的形式存在,细胞膜表面部分的CD2v蛋白与宿主T淋巴细胞表面特有的CD2蛋白共享2个预测的免疫球蛋白超家族结构域,大多数CD2v蛋白分布在细胞质中,定位于细胞核周围,注:CD2v蛋白具有吸附红细胞的特性,有研究表明CD2v蛋白能够促进ASFV在蜱虫体内的复制。

    P72核衣壳蛋白,分子质量73KU,约占病毒蛋白总量的30%,是病毒20面体衣壳结构的主要组成成分,P72蛋白在宿主细胞内合成后分布于细胞质和内质网的囊泡中,P72蛋白形成20面体结构时需要如P49等蛋白的辅助,辅助蛋白的缺失会导致核衣壳正20面体的出现异常。由于P72蛋白免疫原性强且稳定,因此常用于建立血清学检测方法,也有许多基于P72基因建立的ASFV核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR环介导等温核酸扩增。

    P30内囊膜蛋白,分子质量为30KU,ASFV感染早期,通过多种干扰宿主细胞的蛋白质正常合成,以促进病毒自身复制,感染后2—4h产生,在整个感染期间持续表达,目前P30被广泛用于ASFV血清学检测,基于重组蛋白P30的ELISA及免疫印迹可以准确检测ASFV抗体,具有极高的特异性和灵敏性。

    ASFV主要通过网格蛋白介导的内吞作用或巨胞饮作用感染某猪单核巨噬细胞等免疫细胞为适应宿主细胞,ASFV编码蛋白通过多种方式抑制宿主细胞的免疫系统,调控细胞的转录,抑制宿主细胞的蛋白质合成,调节细胞凋亡从而为病毒自身在感染宿主细胞内的繁殖及扩散创造最有利的条件。

     以上三种蛋白是ASFV干扰宿主细胞正常代谢和免疫逃避的关键因素,当然ASFV有多个多基因家族蛋白,其中MGF360/505/530决定于ASFV的细胞嗜性与病毒在巨噬细胞内复制密切有关,是ASFV的毒力决定因素,另外MGF360/505/530还参与抑制宿主干扰素的产生和调控炎性细胞因子表达,并通过延长感染细胞的存活时间来提高病毒在宿主细胞内的增殖效率和数量。

    主要传染源:感染的软蜱,钝缘(媒介昆虫),感染的家猪,野猪,疣猪。机械带毒:鼠,猫,蚊蝇,鸟,污染的饲料,设备,工具,水(有报道水蛭检测带毒时间73天)消化道和呼吸道是最主要的感染途径。

    传播方式:接触,采食,叮咬,工具,注射,配种精液,相对空气传播不大,临床有短距离疑是气容胶传染的个案。

    传播慢,患病率低,致死率高,最低感染剂量:液体1TCTD50(提高猪只的免疫力也是防非的生物安全重要一环。

    案例:A猪场

    2019年10月临床蓝耳活跃抑制猪瘟,伪狂,圆环等基础抗体,而基础抗体高低与PED是有因果关系的。A场在气候没变冷前在蓝耳活跃情况下没采取加强基础免疫措施,12月上旬该场发生PED,加上该场非瘟复产场,非瘟病毒在泥土可成活很长时间,虽然雨靴进猪舍踏了烧碱水,但雨靴底纹有机物并没有干净,雨靴鞋套工作时很容易磨破,异常猪很容易被PD淹盖,1月10日R4栋D29首例确诊非瘟阳性一头到拔牙平稳,基础3600头母猪群最后只剩923头。

    案例:B猪场

    2019年6月初有很多后备母猪(准备配种)咳嗽,喘气,兽医定为传胸,保健药物至稳定,6月20日开始出现产房母猪早产,技术员用头孢类抗生素消炎治疗,第二天该母猪死亡,连续几天母猪死亡,加上样品检测非瘟阴性,判断死亡原因是传胸引起的,7月5日该场13栋1栏一头非瘟检测阳性,B猪场污染面过大,2600头基础母猪群最后拨牙769头,在检测敏感性不强的情况下,低病毒载量时标本实验室就可能查不能,如果核酸检测呈阳性,宿主病毒载量就非常大,污染几率也增大。平时在猪场管理中做好基础免疫工作(其实很多猪场紧张非瘟的困扰,更受到常规病毒如蓝耳,圆环,PED等困扰,任何一种病的发生就增加物,人的流动)

    长期田间总结:控蓝耳高致病活疫苗十抗生素保健,改蓝耳弱毒疫苗或者灭活苗,提示:中国早期蓝耳灭活苗由于抗原低,应激大等原因2010年退出市场,2019年有新的灭活苗上市,强毒活疫苗(长时间使用易毒力反强)转换弱毒苗需做小面积试验或者测序。

    田间证实猪群蓝耳抗体频率呈正态分布且N蛋白抗体S/P值<2.5,表明猪群蓝耳处于稳定状态,其它基础免疫抗体水平就越高(基础免疫高效疫苗的标准:毒株匹配性好,抗原含量合理,纯净度,同源性好。

    如果疫苗杂蛋白多,所带来的后果:应激大,干扰免疫应答,影响免疫效果,降低猪只生产性能这也不利于防非)田间证实:母猪每年基础免疫增加普打二或三次支原体疫苗,因为猪胸腺是产生丅细胞的重要器官,如果猪群正常,健康,平稳生产,生物安全工作扎实稳妥,就不会犯其它疫病带来麻痹大意)饲料:10的4次立方TCTD50

    病毒活性:在适宜的蛋白环境中能够在较大范围的温度和PH范围存活。病毒抵抗力较强,冻肉状态存活数十年,4℃存活一年以上,常温存活数周,56℃存活70分钟,60℃存活20分钟,80℃存活3分钟,无血清时在PH3.5—12的环境中保持稳定,有血清时在PH3—13环境中保持稳定,PH13环境下没血清可存活21h,有血清能存活7天。(有报道:粪便和尿中感染存活时间:4度分别为8.48天和5.33天,37度分别为3.71天和2.88天)。泥巴表面可存活3到4天,有报导非瘟病毒在地表深20㎝处存活一年的记录。

    杀灭方式:火,病毒最怕高温,考虑热传导作用时间,注意防火安全。熏蒸:不要叠堆,注意密封与作用时长。静置,紫外线对非洲猪瘟病毒核酸有很好的降解作用,静置(需消杀过后干燥)作用时间10天以上,可以把物质提前采购。5—20mg/L臭氧水可在1分钟将ASFⅤ灭活,表明臭氧水可用非洲猪瘟有效消毒剂,但还没有在猪场大面积使用。空气过滤或水过滤很少有猪场做,任何消毒注意它的作用时间,有机物严重干扰消毒效果,碘与阳离子表面活性剂,非离子表面活性剂相容性好。

    有效消毒剂的评价:灭杀ASFV核酸效果的测定,实验结果:臭氧和紫外消毒受遮挡的影响,(84,漂白粉)次氯酸盐对病毒核酸有良好的降解作用,但挥发性强,有效氯作用时间短,柠檬酸,洗百健,过氧乙酸,戊二醛对核酸降解效果不明显,卫可主要成分是过硫酸氢钾能产生生物杀灭剂高活性氧,氧化因子和氯化钠通过化学反应产生氯化因子,综合具有氧化.氯化.酸化三合一功效,适用带猪消毒,浸泡。2%—8%烧碱消毒液,PH>12(以上消毒液作用时间都不得少于30分钟)能把温度调到30度(阳性栏拨牙)渗透力更强,因为病毒表面第一层脂质层,注意:短时间不能酸性,碱性消毒液交递使用,结果会环境pH值不达标失去核酸降解作用,如何把病毒阻断在猪场门外或者第一时间沿着病毒传播路线阻断病毒传播,努力将病毒控制在点状发病区域避免出现病毒蔓延后引发的生产停摆,合理正确使用消毒药或消毒方式才能起到安全,有效的作用。

    病理变化:生物安全猪场严禁剖检(血污染很难净化,如要剖检需提前选择强有力的消毒剂和方式),节选几点非瘟猪只死亡解剖概况:脾脏肿大,是正常脾3—6倍,颜色暗黑,脆,抖二下就断。淋巴结增大,水肿,出血,皮下出血,肝充血和胆囊出血,胃肠增大,肾表面瘀点,肺叶有瘀点,心包积液,气管和支气管有泡沫。

    非洲猪瘟临床症状:高热40.5—42℃,耳,四肢,腹背部皮肤有出血点,发绀,呕吐,精神沉郁,不食,少食,腹泻便秘,粪便带血,不愿站立,步态僵直,呼吸困难,湿咳,妊娠母猪流产,死胎,最急性突然死亡,不表现为任何症状。

    诊断方法:实验室诊断,病原学:病毒分离—血细胞吸附试验,直接免疫荧光法,普通PCR和荧光定量PCR,双抗体夹心ELISA测定ASFV。

    血清学:间接ELISA检测ASF特异性抗体,阻断ELISA检测ASF特异性抗体。

    PCR是监测急性或亚急性临床感染猪只病毒血症的基本诊断工具(1)非洲猪瘟发病急,病程短,需快速确诊。(2)潜伏期和发病期以抗原检测进行确诊。(3)病毒变异之后,毒力的变化不尽相同,变异的毒株毒性有可能会表现变强,但也可以表现为减弱,当宿主与病毒处于平衡时,猪只在临床不表现任何症状,而且抗原检测显示阴性,但血清有非瘟病毒,检测抗体呈阳性,因此,在猪群净化和引种时,抗体检测有价值。

    实时荧光定量PCR:只有最敏感的PCR检测方法才能在感染的最初几天检测到低的病毒载量并在慢性和亚临床感染过程的猪只中诊断出弱散发性的病毒血症。(样本中核酸含量越高,越早可被检测到,Ct值越小,样本中病原原始拷贝量越高),对于急性非洲猪瘟,病毒检测PCR最有用,血清学诊断价值较低,因为大多数猪在抗体反应前死亡,在7—10天内,ASFV是中等毒力或者弱毒力毒株之后,抗体检测的作用凸显。

    样品注意要点:采样一定注意生物安全,抗凝血(活动物)切忽冷冻,血清短期4度保存,长期一20℃以下冷冻保存,淋巴结,脾脏,扁桃体,肺脏,肝脏,肾脏,棉试子,粪便,仔猪尸体,流产胎儿短期4度保存,长期需一70℃以下冷冻保存,蜱—干燥保存。

    血液,淋巴结病毒含量较高,鼻和肛粪便试子病毒水平较低,病毒散毒发生于临床症状出现前二天,口腔液,咽喉试子作为早期诊断推荐样品,血样,组织样推荐为确诊样品,在高毒力非洲猪瘟病毒中,在血液,脾和淋巴结中病毒滴度高。

    ASF疫苗:目前没有ASF合法疫苗。疫苗商品化,安全性是放在第一位,其次才是有效性,西班牙早年也出过ASF疫苗,由于出现负反应,不安全停下来了,猪只多数疫苗研发是用异缘动物传代的,如:古典猪瘟疫苗是兔子传代,但ASFV只感染猪只,异体建立不起传代,也就没有异种宿主近亲病毒可借用。

    阻断技术:ASFV感染猪而不感染别的动物,很容易想象ASFV与猪之间一定存在一些特异性的相互识别系统,ASFV结构当中的免疫原性蛋白,P72,P53蛋白以及猪口鼻黏膜的受体两部分组成,ASFⅤ这把钥匙打开了猪身上的这把锁,自然就侵入机体,打开了通道,在生物安全不能做到100%的情况下,阻断ASFⅤ从猪体外进入猪体内,就是我们最后的一道屏障,技术运用ASFⅤ免疫原性蛋白与猪体受体两者之间一把钥匙与锁的关系,利用基因克隆和蛋白重组技术在乳酸杆菌特异性的表达出ASFⅤ结构当中,这个免疫(原)性蛋白,P72,P53蛋白,就如同复制出大量优先占位口鼻黏膜受体的这些假钥匙,提前将锁孔都堵上,进而封闭口鼻黏膜受体位点,病毒再来侵袭时,口鼻受体结合位被假钥匙占据了,ASFV携带这把真钥匙就无法插进去,就如同给猪点戴上口罩,可以很大程度阻断ASFv对猪只的感染,当然,如果该技术成熟,一定能够为我们防控非瘟再加上一道强有力的保障。

    临床诊断:对疑似猪只也有临床经验丰富的管理员诊断与实验室检测相一至,所有临床方法都是为了快速剔除阳性猪,减少污染的风险。在疫病的早期阶段或少数动物受到感染时,可能很难实现临床诊断,因其症状容易与其它疾病的症状相混淆,临床诊断通常是推测性的,在实验室确诊前,任何诊断都不具有结论性,因此提升实验室的检测能力也是防控ASFV的重要手段。所以现阶段加强生物安全如:洗消,烘焙,隔离,静置,干净,关口,采样检测,环控管理,区域不同,场区建设选址不同等各方面因素都和生物安全息息相关,如南方非瘟多发于夏季,因为梅雨季节,雨水和排污等因素,防非明显受气候影响。而北方非瘟病毒冬季可存活甚久,导致了北方反而在冬季多发。养猪人应该把生物安全意识贯穿于整个养猪生产过程中,观念,操作科学与否直接影响行为的结果,关乎养猪效率,关乎猪场存亡,生物安全只有100分,没有99分,猪场如果发生一例非洲猪瘟,生产就停摆,拨牙,检测,潜伏期到安全期的静默等待,恢复到正常生产,连锁反应吃空饷的母猪增多,保育,育成猪只死淘率增加。所以生物安全是猪场稳定生产的唯一出路。

    结束语:此文章只提到ASFV几种蛋白表达,省略多数ASFV蛋白曲线编码,不作学术交流,意愿提高猪场一线员工对非洲猪瘟的认知度,为提高猪场生产成绩提供一点帮助。


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