上接：2016年奶牛产业技术发展报告（1）
3.3 奶牛常见病防控研究进展
3.3.1 奶牛口蹄疫诊断及防控
口蹄疫属于奶牛高发病率，并有很高的致死率，给各国造成了巨大的经济损失。Bachanek-Bankowska等研发出了口蹄疫病毒（FMDV）血清型特异性实时荧光定量PCR方法，该方法能够很好地检测东非A型、O型、SAT1型、SAT2型口蹄疫流行株。Gorna等建立了一种用于检测FMDV的TaqManRT-PCR方法，可快速有效检测FMDV。Biswal等在大肠杆菌表达了FMDV3A重组蛋白，并以此为抗原建立了3A间接ELISA方法来检测FMDV感染特异性抗体，符合率达到93.62%。Ambagala等建立了针对FMDV3D基因的可应用于牧场检测的绝缘等温RT-PCR方法，可检测9个拷贝的FMDVcDNA，可靠性为95%。
Schutta以腺病毒为载体构建的A24克鲁塞罗血清型口蹄疫亚单位疫苗AdtA24免疫牛，结果表明AdtA24非佐剂疫苗能够安全有效地提供免疫保护。
3.3.2 奶牛病毒性性腹泻诊断及防控
2016年的奶牛病毒性腹泻率在巴西、西班牙、土耳其等国的阳性检出率处在较高水平。Losurdo等建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，可对BVDV-1型（BVDV为牛病毒性腹泻病毒）、BVDV-2型和新出现的HoBi-like病毒进行检测，最低能检测到10拷贝的病毒RNA。Mahmoodi等利用大肠杆菌真核表达系统成功表达了MBP-NS3蛋白，建立了BVDV间接ELISA诊断方法，该方法的灵敏性和特异性分别为94%和98.8%。Behera等利用酵母表达系统成功表达了BVDVE2蛋白，并利用该系统建立了BVDV中和抗体的ELISA检测表达方法，和血清中和实验相比，具有较高的符合率。
Padilla等研究表明从白蚁丘中分离的链霉菌属的放线菌分泌的化合物CDPA27具有抗BVDV活性。Pecora等构建了BVDV的E2昆虫杆状病毒单链抗体融合蛋白的表达载体APCHI，研制了BVDV1a-1b-2a-多价E2疫苗，具有较好的免疫效果。
3.3.3 奶牛乳房炎诊断及防控
奶牛养殖业中由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎是造成牛场常见多发病之一。Martins等通过研究葡萄球菌分离株的生物膜产生和抗微生物抗性，发现这可能是导致病原体在畜群中持久性存在的原因。Belmamoun等通过对250个奶牛场共981个生奶样品进行了加州乳腺炎试验（CMT）来诊断亚临床乳腺炎的存在，结果表明在阿尔及利亚西部消费的生奶中存在多重耐药的葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的患病率相比更高。Gunther等研究表明乳腺上皮细胞在炎症发生时，细胞因子、化学因子和TLR受体等与免疫相关的基因表达量增加。
Stangaferro等研发了结合反刍时间和身体活动的警报系统（健康指数评分，HIS）的自动化健康监测系统（AHMS）来识别具有乳腺炎的奶牛，结果表明自动反刍和活动监测能有效鉴别由大肠杆菌引起的临床乳腺炎病例和另一种健康失调的乳腺炎病例，该健康监测系统可以与传统方法结合使用或作为补充来进行乳腺炎的检测。近几年，药用植物作为治疗这种病症的重要替代物的研究不断出现。Sadek等评价验证了急性期蛋白（APP）、促炎细胞因子和氧化应激生物标志物可作为临床和亚临床乳腺炎的生物标志物。Leal等研究表明，与仅用阿莫西林和克拉维酸治疗组相比，糜蛋白酶结合BLA能够改善急性乳腺炎的治疗效果，控制乳腺感染。
3.3.4 奶牛瘤胃酸中毒诊断及防控
高产奶制品系统需要淀粉含量丰富的饲料，而这极易诱导奶牛瘤胃酸中毒。Garrentt等总结了奶牛亚急性瘤胃酸中毒（SARA）的一些特点，发现瘤胃酸中毒不一定引发产奶量下降等。Malekkhahi等在奶牛亚急性瘤胃酸中毒期间添加活性干酵母和苹果酸，发现补充活性干酵母（ADY）能够改善奶牛瘤胃的功能。
3.3.5 奶牛酮病诊断及防控
Holtenius等根据酮病发病时间及体况的特殊型，同时结合血糖含量，将奶牛酮病分成Ｉ型与Ⅱ型；Ⅱ型酮病的发病特征为高酮体、高胰岛素、高游离脂肪酸和血糖含量较高或者正常，其发生可能与饲喂过度导致血糖和胰岛素的水平升高有关。奶牛酮病的病因主要有：奶牛产犊后泌乳高峰早于食欲恢复时间；日粮配比不当或供应不足；奶牛干奶期营养过剩，过于肥胖。除以上3种主要因素外，奶牛光照不足，运动量少，碘、钴、磷等微量元素缺乏，维生素A、B12等缺乏，患有子宫炎、乳房炎等疾病以及采食丁酸盐含量较高的饲料等原因都可以引发奶牛酮病。根据奶牛酮病的病因，治疗原则主要包括补糖、抗酮和对症3方面。
3.4 牛奶质量监控和乳制品加工技术进展
3.4.1 牛奶质量安全监测
液态奶产品微生物检测及控制技术一直备受关注。Abouelnaga等开发了一种实时PCR方法用于特异性检测超高温奶中的耐热芽孢杆菌（Bacillus sporothermodurans），通过分析GenBank中耐热芽孢杆菌的16SrRNA序列选定目标区域，并使用参考菌株测定标准曲线，其最低检测限度为10CFU/mL；使用该技术对市售超高温奶样品进行检测结果表明，该技术与使用传统平板计数的结果具有非常高的相关性。随着人们对黄曲霉素（AFB1）的研究，目前已经筛选出AFB1的具有特异性高、亲和力强的核酸适配体，并得到了广泛应用。Seok等利用一种超灵敏的比色法的策略进行AFB1的检测，该技术结合核酸适配体特异性的靶标通过脱氧核酶产生肉眼可见颜色信号，操作简单，检出限达到0.1μg/L。
3.4.2 乳制品加工研究进展
2016年7月份欧盟发布（EU）2016/1189委员会实施决议，批准紫外线处理牛奶作为新资源食品。加工工艺要求为紫外线波长200~310nm，能量输入1045J/L；在牛奶经巴氏灭菌后通过紫外线处理牛奶，可以将7-脱氢胆固醇转化为维生素D3，进而增加乳品中维生素D3含量；经过加工后全脂巴氏杀菌乳和半脱脂巴氏杀菌乳中维生素D3最高限量要求分别为5~32μg/kg和1~15μg/kg，适用于除婴儿之外的所有人群。
Gómez-Gallego等研究发现加工工艺的差异会影响乳粉多胺含量和消化后的多肽种类；人奶和婴幼儿奶粉消化后的多胺和多肽的差异可能是造成母乳喂养和采用奶粉喂养的婴儿健康特征差异的一个原因，在未来设计婴幼儿奶粉的过程中应该充分考虑这2种活性物质的需求，有助于提高婴幼儿的身体健康状况。
4 国内奶牛产业技术研发进展
4.1 繁殖与育种技术进展
4.1.1 全基因组关联分析研究不断深入
全基因组关联分析（GWAS）研究是利用全基因组范围的连锁不平衡探索或挖掘与复杂性状有关的基因或标记位点，是最近几年来被广泛应用的揭示复杂性状遗传基础的强有力策略。秦春华等首次把全基因组关联分析的策略应用到中国荷斯坦牛种公牛精液性状的遗传基础研究中，发现19个影响精液性状的SNPs达到显著水平，这些SNPs位于20个已知基因内部或附近。并且，综合GWAS结果和基因的生物学功能，确定ETNK1、PDE3A、PDGFRB、CSF1R、WT1、RUNX2、SOD1和DSCAML1等8个新发现的基因可作为影响公牛精液性状的候选基因。李聪等利用GWAS鉴定牛脂肪酸含量候选基因，共发现84个全基因组显著水平SNPs和314个潜在显著SNPs同18个脂肪酸性状关联；结合乳成分数量性状位点（QTL）区域及基因功能注释，提出了20个新的候选基因，为后续开展分子标记辅助选择等育种措施培育低脂高蛋白奶牛新品系提供了基因来源和原动力。
4.1.2 全基因组选择技术进展
全基因组选择（Genomic Selection，GS）指通过检测覆盖全基因组的辅助标记，利用基因组水平的遗传信息对个体进行遗传评估，以期获得更高的育种值估计准确度。该技术自2009年美国率先在奶牛遗传评定中应用以来，北美和欧洲对其不断深入。根据农业部的要求，2016年利用中国农业大学自主建立的我国荷斯坦牛基因组选择技术平台，对国内28个公牛站的2336头青年公牛进行了基因组检测和遗传评估，选择出248头GCPI值在1500以上的优秀青年公牛为全国良种补贴项目，为保证良种补贴公牛的遗传质量提供了科学依据。2016年，由张勤教授主持申报的“中国荷斯坦牛基因组选择技术平台的建立与应用”获得国家科技进步二等奖。
2016年进一步完善了中国荷斯坦牛数据库，推进奶牛品种登记、数据分析服务、不断完善和升级了奶牛生产性能测定等工作。2016年新增荷斯坦牛品种登记9.2万头，配合农业部开展了三河牛、奶水牛等奶畜遗传资源的调查和品种登记工作，建立奶牛场选种选配、后裔测定等技术规范。
4.1.3 结合表观遗传学解释低遗传力性状遗传与环境互作的研究成为热点
奶牛遗传学领域中，针对采用传统育种、兽医及管理方法，都难以有效防控的金黄色葡萄球菌隐性乳房炎，Song等从表观遗传的DNA甲基化、组蛋白甲基化和miRNA3个方面，系统深入地研究了金葡菌隐性乳房炎牛的表观遗传标记及靶基因，其中NAT9、IL10、JAK2等基因与金葡菌隐性乳房炎抗性密切相关，体外细胞水平试验也对这些基因的功能进行了验证，为奶牛抗金葡菌隐性乳房炎提供了重要的表观遗传标记。
4.1.4 胚胎工程技术进展
我国奶牛胚胎移植研究始于20世纪70年代后期，近年来动物胚胎体外生产技术进展较快，包括幼龄家畜体外胚胎生产技术（JIVET技术）、性控胚胎生产、精子胞内注射等。JIVET技术原理是将幼畜超数排卵与卵母细胞的体外成熟、卵母细胞的体外受精、胚胎的体外培养和胚胎移植等技术集合而成的生物高技术繁殖体系，可以极大程度缩短世代间隔，为胚胎生产和研究提供丰富的资源。安晓荣等利用JIVET技术建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法，平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚；在体外成熟、体外受精过程中，卵母细胞受精率达到63.2%，与成年牛（59.7%）差异不显著；胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%，仍显著低于成年牛（48.0%）；对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植，受孕率达到66.7%。
4.2 饲料与营养技术进展
4.2.1 碳水化合物营养
Zhang等研究表明，高海拔地区奶牛瘤胃微生物可以更有效利用碳水化合物，提示可通过调节瘤胃微生态状态调节奶牛碳水化合物的消化。马健等研究发现，禾王草无论干草还是青贮，其瘤胃消化性能均与青贮玉米相当而高于羊草，表明禾王草适宜作为奶牛粗饲料。付瑶等研究表明，NDF含量为25.05%的日粮有利于氨氮的利用和瘤胃发酵。郭勇庆等研究表明，奶牛日粮中可用适当比例的粉碎小麦替代玉米，替代比例不宜超过日粮DM的19.2%；高比例小麦日粮饲喂奶牛可引起瘤胃pH和乳脂率下降，进一步引起乳脂组成发生变化。史海涛等研究发现，用CaO处理秸秆可提高奶牛对秸秆的消化率，最有效和最经济的处理方式为5%CaO加60%含水量。李妍等[21]研究表明，围产后期奶牛日粮中添加瘤胃保护葡萄糖有利于奶牛产后体况的维持，降低产后能量负平衡的发生。
4.2.2 蛋白质与氨基酸（AA）营养
Zhou等通过测定不同肝功能指数奶牛血浆中氨基酸表达谱和生物标记物，发现炎症反应、产后肝功能和血浆中氨基酸浓度间存在相关性。肝功能较好的奶牛产奶量更高，且能维持体内较高的总氨基酸浓度，尤其是苏氨酸和异亮氨酸的浓度。周刚等研究发现，颈静脉灌注精氨酸提高了乳蛋白中α-酪蛋白和κ-酪蛋白含量，以及CSN1S1、CSN1S2在奶牛乳腺组织的表达量。王珊珊等[22]研究表明，组氨酸可以促进乳腺上皮细胞的增殖以及β-酪蛋白表达；在最适浓度0.15~9.6mmol/L内，组氨酸通过促进β-酪蛋白表达，最终调控乳蛋白合成。
4.2.3 脂肪营养
Yang等报道，奶牛日粮中添加杜松精油、大蒜或莫能菌素有望提高乳脂脂肪酸及t10,c12CLA（共轭亚油酸）的比例。姚喜喜等在全混合日粮（TMR）中添加牛至精油，发现能降低TMR温度、改善适口性、提高新鲜度，还可增加奶牛干物质采食量及产奶量。李大彪等报道，亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪和乳蛋白合成有较好的促进效果。袁雪等报道，3种过瘤胃脂肪（脂肪酸钙、氢化脂肪和分馏脂肪）的添加改善了泌乳前期奶牛体况，提高了产奶量。刘可园等研究表明，以乳脂奇数和支链脂肪酸含量为基础得到了预测瘤胃液中各种VFA含量的回归方程。
4.2.4 矿物质与维生素营养
李雪等发现，维生素A、D、E注射液对奶牛同期发情有很好的诱导作用。姚震等发现，复合水溶性维生素可提高奶牛生产性能，增强奶牛非特异性免疫，改善奶牛抗氧化性能，减少夏季热应激。王丹等发现，日粮添加有机硒可提高奶牛的抗氧化、免疫和消化功能，提高奶牛产奶量，降低乳中体细胞数，提高奶牛繁殖性能等。庄安宁等发现，日粮中添加富硒酵母显著提高了牛奶硒含量，增强了奶牛机体健康。
4.2.5 粗饲料资源利用与评价
尹强等研究发现柠条可通过微贮、膨化或制粒的方式降低纤维素和木质素含量，改善适口性和消化率，其中以微贮效果最佳。黎力之等评定了6种经济作物副产物（大豆秸、甘蔗梢、油菜秸、苎麻、花生藤、莲叶）营养价值，发现荷叶营养价值最高，油菜秸营养价值最低，6种经济作物副产物都可作为反刍动物的粗饲料来源。冀凤杰等研究表明，木薯渣具有高碳水化合物、高矿物质、低蛋白质的特点，作为粗饲料具有较高的营养价值。
4.2.6 奶牛营养与环境
奶牛场周边N主要是以NH3沉积的形式排放，提高瘤胃可降解淀粉等措施均可减少奶牛氮排放。益生菌添加剂可改善泌乳中后期的奶牛瘤胃发酵环境，减少氮素排放。饲粮中添加稀土、小肽可以减少奶牛氮排泄。微生态制剂能够减少瘤胃内甲烷的排放量。日粮中添加硝酸盐增加了粪便堆积过程中CO2、CH4和N2O的排放。
4.3 奶牛常见病防控研究进展
4.3.1 奶牛口蹄疫诊断及防控
全国口蹄疫疫情总体呈下降趋势，根据兽医公报公布，2016年分别在3月和6月出现两次口蹄疫疫情，均为小规模的O型FMDV感染。
梁伟峰等建立了检测Asia1型FMDV抗原的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。张蕾等建立了牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法，该方法敏感性为96.7%，特异性为99.1%，与2种商品化试剂盒比较，符合率分别为93.5%和85.9%。袁红等为研制针对我国边境地区（尤其是西南边境）流行的A型口蹄疫（FMD）的标记疫苗储备病毒株，通过化学合成东南亚地区流行的A型FMDVA/VN/03/2009株的P1基因，构建FMDVA型和O型嵌合的全长重组质粒，经酶切线性化后转染于表达T7RNA聚合酶的BSR/T7细胞中，拯救得到FMDV重组病毒。经检测表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3Aaa91-aa105缺失的重组病毒，为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。
4.3.2 奶牛病毒性腹泻诊断及防控
造成犊牛腹泻的主要病原有BVDV、轮状病毒、隐孢子虫及大肠杆菌等，关于BVDV的研究比较深入。侯佩莉等根椐GenBank中已发表BVDV、中冠状病毒（BCoV）和中肠道病毒（BEV）基因的保守序列，建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法，该方法最低能检出6.4pg的BVDV，1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板；对24份临床腹泻病料进行检测，与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%；所建立的多重RT-PCR检测方法，可用于临床混合感染的同时检测。
4.3.3 奶牛乳房炎诊断及防控
奶牛乳房炎的综合防控技术是目前研究热点。李洋洋等研究以刃天青钠取代链球菌选择培养基EN的溴甲酚紫指示剂，建立了奶牛乳房炎链球菌快速诊断与药敏试验用微量板。阿得力江.吾斯曼等研究发现，阿里红活性部位提取物体外试验能够抑制奶牛乳房炎致病菌。叶文初等研究发现，丹参酮乳房注入剂对奶牛乳房炎有临床治疗效果，且效果明显优于双丁注射液。李振等研究发现，头孢噻呋又名赛得福（是动物专用的第三代头孢菌素类抗生素）对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有超广谱强效抗菌作用，在兽医临床应用中具有广阔的前景。
中草药含有多种生物有效成分，对奶牛效果良好，毒副作用甚微，作为奶牛乳房炎的治疗药物克服了抗生素的某些不足，在防治奶牛乳房炎方面具有独特的优势，引起了国内外学者的关注。单冬丽等研究发现，8味中草药及复方对奶牛乳房炎的6种致病菌有明显的抑菌作用，其中瓜蒌、金银花抑菌作用最强，其次为连翘、白附子和天花粉。
4.3.4 奶牛瘤胃酸中毒诊断及防控
亚急性瘤胃酸中毒（SARA）是现代集约化反刍动物生产中的常见营养代谢病。木哈达斯.木汗等认为，酸中毒多发生于奶牛，主要因精饲料比例不当造成；以1~3胎的奶牛发病最多，7胎后的发病率较少；一年四季均可发生，但以冬春季较多；临产牛和产后3d内的奶牛发病较多；产奶量愈多，发病率愈高。黄显晔认为，奶牛采食过量的谷物饲料后如果发现患酸中毒，要立即采取救治：适量的小苏打溶液灌入到病牛瘤胃中，冲出一些谷物，接着灌入1000~1500mL液体石蜡油，再静脉注射500mL的5%碳酸氢钠和1000mL葡萄糖盐水，之后停止1d采食就能够治愈。陈菲等做了一例奶牛瘤胃酸中毒的诊治，通过排除瘤胃内容物、中和胃酸、补液强心及对症治疗后完全治愈。
4.3.5奶牛酮病诊断及防控
酮病属我国奶牛养殖中的常见病。马建民等建立了紫外分光光度法检测牛奶中β-羟丁酸含量的方法，相关系数（R2）为0.9972，平均回收率为104.0%，说明本方法可用于牛场奶牛亚临床酮病的筛查和研究。朱奎玲等研究发现，酮病奶牛泌乳量显著降低，泌乳周期延长，同时配种次数、配种天数、产犊间隔延长；乳蛋白、乳糖水平低下；尿液中磷的排放量增加，给环境污染造成巨大压力。
刘建波等选择了黑龙江省2个集约化牛场开展了高产奶牛酮病的流行病学调查工作，发现该牛场未采取预防措施前，发病率高达40%以上，患酮病奶牛表现低血糖症、高酮和高游离脂肪酸的生化特征，常伴有泌乳量下降和繁殖性能低下，还会增加其他疾病尤其是蹄叶炎的风险；灌服丙二醇有效地降低了奶牛酮病的发病率（低于25%）。周媛丽等通过研究饲粮硒含量对酮病奶牛氧化应激的缓解作用，确定了酮病奶牛对硒的最适需求量。
4.4 牛奶质量监控和乳制品加工技术进展
4.4.1 牛奶质量检测
乳品安全检测技术仍是研究热点。李琴等使用超高效液相-串联质谱法同时测定生鲜乳中包括泰乐菌素和环丙沙星等45种兽药残留，该方法具有样品操作简单、成本低、测定周期短和灵敏度高等优点，其成功应用将为当前生乳中兽药的检测提供便利。赵清华等提出了一种同时进行生鲜牛乳酒精实验和掺碱实验的方法。此方法结合酒精实验和掺碱实验国家标准，使用玫红酸（0.5g/L）的酒精溶液（76%）为检测试剂，通过一次检测成功对牛乳的新鲜度和是否掺碱进行判定。王亦琳等建立了一种可同时检测牛奶中4种阿维菌素类药物（阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃谱利诺菌素）残留的液相色谱-串联质谱方法，具有简便快速、灵敏度高、定性准确，重复性好等特点，可以满足牛奶中4种阿维菌素类药物残留检测的要求。
4.4.2 乳制品加工研究进展
基础理论研究方面，叶清等开展了人初乳与牛初乳乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白质组成的对比研究，结果发现人初乳乳清蛋白和脂肪球膜蛋白的组成和代谢情况与牛初乳蛋白存在巨大差异，此研究结果为基于牛初乳的婴幼儿初乳配方食品设计提供了理论基础。
配方设计方面，特殊配方产品开发成为热点，针对早产和低出生体重儿食用的特殊配方奶粉、含益生元和益生菌的婴幼儿配方奶粉、促进新生儿肠道黏膜免疫功能发育的配方奶粉、防止乳糖不耐症和蛋白质过敏的婴幼儿奶粉等多种特殊配方奶粉被设计，并进行了一定的功能效果研究。
乳粉安全性评价方面，采用分子生物学手段评价婴幼儿配方乳粉的安全性取得进展。张和平教授采用最新的PacBio SMRT三代测序技术，较为全面、系统地评估婴儿配方奶粉中微生物的污染情况。研究显示，国内外婴儿配方奶粉污染微生物菌群结构存在差异性；婴儿配方奶粉不同程度上存在过嗜热菌和嗜冷菌，如蜡样芽孢杆菌和Anoxybacillus flavithermus在部分样品中有显著增高的趋势，预示着产品的货架期可能会受到影响。
（李胜利 姚琨 曹志军 刘长全 张胜利 刘建新 李建喜 王加启 张和平）
