猪油是世界上产量最多的油脂，猪油主要由棕榈酸、硬脂酸、亚油酸及亚麻酸等4种脂肪酸组成。猪油价格便宜，在畜禽生产中为降低成本经常被使用。猪油能为畜禽生长提供足够的能量、改善饲料适口性、改善饲料外观特性、提高其他营养成分吸收利用。在炎热的夏季，添加适量猪油，可以起到抗热应激作用。但猪油的品质比较难控制，现在使用猪油的比例逐年减少。
本文从反应温度、缓冲液/豆油摩尔比、pH值、脂肪酶的用量等方面研究了脂肪酶对猪油的催化性能，得到了猪油体外酶解反应的适宜条件，为脂肪酶催化水解法制备脂肪酸的生产工艺提供了技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
猪油：由市场上购买的一般食用猪油，主要成分见表1。
脂肪酶：从市场上A公司购买，由米曲霉发酵生产的脂肪酶。
1.2 试剂及仪器
无水乙醇、乙醚均为分析纯；10mg/mL酚酞乙醇溶液；0.1mol/L KOH标准溶液；电动搅拌机；离心机；精密天平；电热振荡恒温水浴锅。
1.3 试验方法
1.3.1 酶促水解猪油的操作方法
将猪油与水按一定比例混合，用电动搅拌机进行搅拌混合（搅拌3min，停5min，再搅拌3min，以此重复）。把搅拌好的混合液放到45℃水浴锅中，快速加入定量脂肪酶，同时振荡计时。
1.3.2 缓冲溶液
缓冲溶液是浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，调成不同的pH值。
1.3.3 猪油酶解条件的确定
1.3.3.1 酶解时间的确定
水加猪油分别按60︰1、50︰1、40︰1混合，加入10%的脂肪酶，在pH值为7.5，温度为45℃条件下水解，每隔1h测定水解产物的酸值，确定水解时间。
1.3.3.2 最佳水解条件的确定
为了确定猪油最佳的水解条件，以酶解温度、底物摩尔比、加酶量、pH值做四因素三水平正交试验，不考虑交互作用。见表2。
1.4 分析方法
1.4.1 酸值: 根据GB/T 5530-199测定。
1.4.2 皂化值: 根据GB/ T5534-1995测定。
1.4.3 水解转化率:x（%）=AV/SV X100式中：AV-反应过程中酸值，mgKOH/g；SV-豆油的初始皂化值，mgKOH/g。
2 结果与讨论
2.1 酶解时间对猪油水解效果的影响
在猪油中添加10%的脂肪酶，在pH值为7.5，温度为45℃的条件下，改变猪油和水的比例，确定猪油最佳的水解时间。不同酶解时间猪油酸值变化如表3所示。
由表3可知，无论反应物的摩尔比是多少，它们的变化都有一个相同的趋势，即随着时间的增加，水解率也会提高。但是，到了8h时，水解率的变化幅度不大，跟反应7h时的水解率趋于一致，甚至出现下滑的现象。可知，水解时间达到7h后，猪油水解趋于平衡。由此确定最佳反应时间为7h，故以下的水解时间都为7h。
2.2 猪油酶解条件的确定。
不同酶解条件的正交试验结果见指标趋势图1。
对因素A而言，温度对脂肪酶促油脂水解反应的影响较复杂，温度升高对酶促反应产生两种相反的效果。一方面，升高温度可以增加水和油脂的互溶度，增强混合物的流动性，减小传质阻力，有利于水解的进行，反应速度随温度升高而加快，甘油酯浓度降低的速度随温度升高而增加；另一方面，脂肪酶变性失活程度随温度升高也迅速增加，在超过酶的适宜温度范围时，酶失活的速度比反应速度大得多，从而使水解反应速度急剧下降。从表4可以看出，当A处于55℃水平时，均有较高的水解率；当A处于65℃时，猪油水解率降低。因为温度过高，抑制了脂肪酶的活性，导致水解率降低。
对因素B而言，油脂水解反应是可逆反应，缓冲液和猪油摩尔比是油脂水解重要因素。一方面，体系中摩尔比的增加可以推动可逆反应向右进行，从而加速水解反应的进行，提高猪油的水解率；另一方面，由于油脂水解反应在油水界面上，过量的缓冲液可以溶解稀释生成的甘油酸，同样可以提高水解率。超过一定比例就会达到一种平衡状态。
对因素C而言，在酶催化水解中，酶用量直接影响反应速度和达到平衡所需的时间。如果脂肪酶的量太多，产物对酶的抑制作用会使水解效率降低。当脂肪酶用量太少时，酶的活力不足以使甘油酯水解到所要求的程度。但此时若适当提高脂肪酶的用量，水解效率则会显著提高。当脂肪酶用量较大时，产物对酶的抑制作用等不利因素在反应中起主导作用，使水解产率降低。在工业生产中，须参考具体反应体系、操作条件及酶的价格等诸多因素，选择适宜的脂肪酶用量，以获取最好的经济效益。例如：酶用量较低时，可以采取加强搅拌、延长水解反应时间等方法加以弥补。
溶液中的pH值会影响脂肪酶的活性，不同脂酶最适pH不同，且脂酶单独存在与参与反应时所表现出的最适pH值不甚相同。因为反应中pH值的影响是同其他的一些因素如底物的性质、浓度和缓冲液种类等的影响相联系的。相对而言，pH值在5.0～7.5之间变化时，对多数脂解反应影响不大。
由表4可以看出，影响猪油水解的因素，主次顺序为：A>C>D>B。由图1和表4可知，各因素水平的最佳组合为A2+C2+D3+B1。
3 结论
对于脂肪酶催化猪油的水解反应，其最佳反应温度为55℃，pH值为6，适宜的水/猪油的摩尔比为60∶1, 脂肪酶的最佳用量为4%，水解7h，该条件下水解率可达84.21%。在工业生产中，需参考具体反应体系、操作条件与酶的价格等诸多因素，选择适宜的脂肪酶用量，以获取最好的经济效益。
（翁晓辉、王敏、杜红方 广东省饲料添加剂生物工程技术研究开发中心）
