曹建新 齐莹莹 王虹 赵勇
天津市动物疫病预防控制中心
天津市动物卫生监督所
口蹄疫的实验室诊断主要是病原学诊断和抗体检测两个方面， 口蹄疫常规鉴定内容是抗原鉴定和核酸鉴定， 核酸鉴定是近年发展起来的较新的鉴定技术， 其中最常用的是 ＲT － PCＲ 技术。该技术的最大优点是敏感、 快速和可检样品广泛， 经序列测定后， 还可明确被检病毒的血清型和基因型。传统的核酸分离技术包含沉淀、 离心等过程， 这些纯化方法的步骤繁杂、 费时、 收率低， 且需接触有毒试剂， 很难实现自动化操作。而采用核酸磁珠分选纯化系统就能很好地克服这些缺点， 实现样品的快速、高效制备， 是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。笔者根据在实验室批量检测口蹄疫工作的需要，对几种口蹄疫病毒检测方法进行了比较， 以期为批量样品检测试剂的选择提供参考。
1材料
1． 1检测试剂
口蹄疫病毒通用型实时荧光 ＲT － PCＲ 检测试剂盒， 购自深圳太太基因工程有限公司;口蹄疫 ＲT －PCＲ 试剂盒， 购自中国农科院兰州兽医研究所;口蹄疫病毒柱式提取 ＲT － PCＲ 试剂盒， 购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;核酸磁珠分选纯化系统，购自天津市诺尔斯医疗用品有限公司。
1． 2主要仪器设备
CFD － 3200 荧光 PCＲ 仪， MJ Ｒesearch 公司生产;UNOⅡPCＲ 扩增仪， 美国 Whatman 公司生产;MagMAXTMExpress －24 型磁珠处理仪， Invitrogen 公司生产。
2方法
样品来自天津市郊区某生猪屠宰场， 淋巴结 10份、 猪肉 10 份。全部试验均按试剂盒说明书进行。
3试验原理
3． 1口蹄疫病毒实时荧光 ＲT － PCＲ 检测
利用离心柱内硅基质膜提取样品总 ＲNA， 在高效反转录酶的作用下， 以 ＲNA 为模板， 以引物为起点合成与 ＲNA 模板互补的 cDNA 链。在热启动 Taq 酶的作用下， 经高温变性、 中温退火及延伸的循环， 使特异 DNA 片段的拷贝数放大一倍， 经荧光素标记的探针与扩增的 DNA 杂交， 利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性， 使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离， 发出特异性荧光信号， 利用荧光 PCＲ 仪检测特异性荧光信号， 根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
3． 2口蹄疫 ＲT － PCＲ 检测
将ＲNA 的反转录(ＲT)和 cDNA 的聚合酶链式扩增(PCＲ)相结合的技术， 首先经反转录酶的作用从ＲNA 合成 cDNA， 再以 cDNA 为模板， 扩增合成目的片段。
3． 3口蹄疫病毒柱式提取 ＲT－PCＲ
采用离心柱内硅基质膜提取系统和混合酶系统，可以快速有效地进行 ＲT － PCＲ 检测。
3． 4核酸磁珠分选纯化系统
通过特制的磁棒吸附、 转移和释放磁珠， 从而实现磁珠/样品的转移， 实现自动提取纯化操作。
4检测结果
4． 1四种试剂盒的重复性试验
用同一批样品、 同一批号的试剂盒、 同一个操作者进行多次试验， 观察其重复性。试验结果表明:无明显差异。
4． 2四种试剂盒的特异性和敏感性
用已知背景的样品检测， 观察其特异性和敏感性。试验结果表明:荧光 PCＲ 的灵敏度高， 比普通ＲT － PCＲ 试剂盒高 10 ～ 100 倍;核酸磁珠分选纯化系统核酸纯度可达到 95%以上。
4． 3四种试剂盒检测时间的比较
用同一批样品、 四种不同试剂盒、 同一个操作者进行试验。结果见表 1。试验结果表明:柱式提取 ＲT － PCＲ 比普通 ＲT －PCＲ少2．5h。
4． 4四种不同检测方法优缺点的比较(见表 2)
5结论
通过对四种不同口蹄疫检测方法的比较发现， 各种方法各有优缺点， 针对实际批量检测工作的需要，选择一种操作简便、 快速、 更加环保安全、 特异性强、灵敏度高的试剂是非常重要的。
