胚胎移植技术不仅是高效利用优秀种母畜的有效手段，同时也是细胞工程、胚胎工程等动物生物技术实现的重要手段。在胚胎移植过程中，对最终受胎率影响的因素很多，而这些因素依然会在转基因山羊生产中起作用。在生产转基因动物的方法中，原核注射是很有效的技术手段，但是对原核胚胎进行外源基因注射会对原核胚胎产生一定的损伤。在所得的转基因动物中，要求所有分裂后的卵裂细胞都携带目的基因，就要比较严格的控制胚龄，既受精又未卵裂的原核胚，所以对过程的操作要比单纯生产超数排卵和胚胎移植时要求更严格。
本研究利用课题组在最近两年，进行的4次山羊转基因试验，对可能影响山羊转基因胚胎移植受胎率和产羔率的撤栓到输精的时间、受体因素、胚胎类型、移入胚胎数4个方面因素进行观察、统计和分析，目的是得到影响山羊原核注射胚胎受胎率和产羔率的影响因素，以期待今后提高原核注射胚胎的成活率，提高转基因山羊的生产效率。
1材料与方法
1.1药品及设备
试验药品主要试剂见下表1。
其他药品有酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水、青霉素、链霉素。
试验用设备及器械主要有:腹腔镜、腹腔内输精枪、冲卵管、细菌滤器、捡胚针、移胚针、实体显微镜、恒温台、水浴锅、显微注射仪等。
1.2时间和地点
在2010年的5月、7月、12月、2011年12月进行4次超数排卵转基因试验，地点是青岛森淼实业有限公司转基因山羊实验基地。
1.3胚胎的获取
1.3.1试验动物选择
选择膘情好、无明显繁殖疾病、具有正常发情周期的山东本地山羊作为供体和受体。其供体受体之比为1∶2。
1.3.2受、供体山羊同期发情和超数排卵处理
分别以受、供体埋阴道栓当天记0天，在埋栓14天时，在早晨6:00开始给供体羊进行超数排卵处理，每天早晚各一针，采用促卵泡素(FSH)递减法进行，连续8针，每只供体总剂量以6.0U/kg计算药量;在埋栓的第16天晚或第17天早对受体进行撤栓，同时肌注200～250U孕马血清促性腺激素(PMSG);供体在埋栓的第17天时进行撤栓，同时肌注前列腺素(PG)0.1mg;在最后一针FSH注射完的下一个夜晚进行肌注促黄体素(LH)100U;于注射LH天明的当天下午进行腹腔内输精。在输精后的第2天早8时进行手术冲胚。
1.3.3冲胚方法
采用常规手术方法冲胚，以输精时的腹腔镜的入口为基础，以一食指的粗细为准，拉出子宫角进行冲胚，一侧结束还纳后，再拉出另一侧进行冲胚，采用逆向冲胚法，从输卵管伞部回收早期胚胎，在实体显微镜下将胚胎捡出，品质鉴定后，进行胚胎构建。
1.4胚胎构建
选择透明带清晰，胞质均匀、极体或原核清晰可见的受精卵，将制备好的线性化不同浓度的含有目标基因(TLＲ4、表达载体)的DNA注入。注射DNA片段的量为5pl，浓度为10ng/μL。
1.5胚胎的移植
将构建好的原核注射胚胎，采用常规手术方法，移植到适合的受体羊内，在输卵管伞移植到输卵管较深部。
1.6受胎率的确定
以最终产羔来确定其受胎情况。
1.7数据分析
采用Excel中的数据分析软件和利用“两样本百分数差异显著性检验”的公式，输入Excel表格中计算进行差异显著性分析。
2结果与分析
2.1供受体撤栓时间差和输精时间对原核移植效果的影响
本研究对近几年所做的山羊不同输精和撤栓时间对受胎效果的影响进行了统计分析，其效果如表2、表3所示。
本对比主要以2010年12月进行的试验中不同的撤栓、输精时间和2011年12月进行的试验进行比较，比较结果:1—3组在母羊妊娠率上没有差异，而2组在受体妊娠率上显著高于4组，其他组差异不显著。将前三组输精时间较近组合并后，即撤栓到输精50～51h组在受胎率上极显著高于55h组。在每只羔羊所需的胚胎数上，第4组所用胚胎数极显著的高于其他三组，其他三组差异不显著。
2.2供、受体做受体对移植受胎率的影响
本研究对近几年所做的供、受体做受体移植对产羔效果的影响进行了统计分析，其效果如表4所示。
在2010年12月份和2011年12月份进行的试验进行了统计分析，其结果是:2次试验中的供体做受体和受体移入胚胎，在受胎率和每只羔羊需要胚胎数上差异均不显著，两者的受胎率和每只羔羊需要胚胎数在统计学上没有差异。
2.3胚胎类型对产羔效果的影响
目的是生产原核细胞进行原核注射，但2细胞也进行了注射，在两者受胎率上，两者差异不显著;在产羔效果上，2细胞注射胚胎每只羔羊所用胚胎数显著低于原核注射胚胎数，两者接近极显著水平。
2.4移植胚胎数量对受胎率及产羔数的影响
将构建好的原核注射胚胎，分别按4枚/只、5枚/只、6枚/只以上，移植到与供体羊发情同期化的受体羊输卵管内，以最终产羔为统计指标，各组在受体羊妊娠率上差异不显著;在每只羔羊所用的胚胎数上，6枚/只以上组显著高于4枚/只组。
3讨论
3.1供受体撤栓时间差和输精时间对原核移植效果的影响
在本研究中，2组和4组差异显著，而两组供受体撤栓时间差分别是8h和9h，这两组分别与其他两组，供受体撤栓时间差分别是6.5h和12h，结果差异都不显著说明在本试验中说明6.5～12h供受体撤栓差，对最终的结果没有影响，结果的差异不是来源于本影响因素，主要是来源于不同的输精时间上。
在本试验中，在供体羊撤栓后20h后，就大部分供体羊开始发情。山羊发情开始到排卵的时间上，各种报道差异比较大。杨增明等报道中发现山羊的排卵时间为发情开始后约30h;王杏龙等报道，波尔山羊从发情开始至排卵的时间为29h。2011年网上文章报道母山羊一般在发情后24～36h排卵，卵子保持受精能力的时间为5～6h。本人没有查阅到山羊的精子射精到输卵管出现精子的时间，参考牛和绵羊的这个时间2～13min和6min，来参考计算山羊的这个时间，本试验采用腹腔内输精，这时间远短于山羊精子获能时间4h。也就是撤栓后20h开始发情，发情后29或30h排卵，卵子排出后2～3h才能被精子穿入。卵子保持受精能力时间为5～6h，精子获能时间是4h，而精子维持受精的时间为24～48h，时间足够不必考虑计算。综合以上时间计算:即(撤栓到发情时间+发情到排卵时间+卵子具有受精能力的时间)到(撤栓到发情时间+发情到排卵时间+卵子最长具有受精能力的时间)这段时间为精卵最佳受精时间，即20+29+3=52到20+29+6=55h，这正与撤栓后50～51h时输精加上精子获能时间4h，54～55h的时间相吻合。这样精卵结合效果较好，有利于后面的原核注射胚胎的构建;而在54h输精时，再加上精子获能的时间，很多卵子已经老化，或失去受精能力，或是异常受精，或受精卵耐受力下降，对注射的抗性下降，从而导致其受胎率后者低于前者。在每只羔羊所用胚胎方面，前者胚胎质量好，所以也远高于后者。综上所述，在山羊原核注射时，山羊腹腔内输精应在撤栓后50～51h为宜。
3.2受体因素对胚胎的影响
在本试验中，研究了受体因素对受胎效果的影响，在几次大试验中都选用了供体作为受体，在受胎效果上供体做受体和原本的受体没有差异，可以作为受体使用;虽然，供体在超数排卵的过程中，对其使用了大量的外源激素，有人担心其内分泌可能紊乱，而在没有移植的供体中也有2只供体羊产羔了(如表9)，也说明了供体是可以使胚胎着床使其正常发育的，在做受体方面是可以选用的。这与2012年汪立芹等在绵羊上所报道的相同。
3.3胚胎因素对受胎效果的影响
本研究在原核胚和2细胞胚的注射后移植效果进行分析，其结果表明:在受胎率没有差异的情况下，两者的胚胎产羔效率差异接近极显著水平，说明2细胞的产羔效率远高于试验中的原核胚，这说明，在试验中的原核胚胎有一些是劣质胚，或是未受精卵，在品质鉴定时区分不清;也有可能2细胞胚在胚胎注射时，即使一个细胞因注射死亡，另一个细胞也有发育成了个体的可能，而原核注射胚胎就一个细胞，注射损伤后死亡就不能发育了。所以胚胎产羔效率2细胞显著高于原核注射胚胎。
在试验中分别用4枚/只、5枚/只、6枚/只以上进行移植，胚胎移植数的提高，并没有提高受体的受胎率;而随着移入胚胎数量的增加，产羔效率却降低了。汪立芹等报道在绵羊上所报道，移入2枚/只的和移入3枚/只的，受胎效果高于1枚的。可见一定数量上增加原核注射胚胎数量可以提高受胎率，从而提高受体利用率;而胚胎过多会降低原核注射胚胎的使用效率。这是因为原核注射胚胎在注射外源基因时，对胚胎造成了损伤，在一定数量可以起到补充的作用;而胚胎数量继续增加，胚胎可能产生一定的相互竞争，而不利于胚胎生长;胚胎增加，增加了受体因素的影响，若遇到合适的受体，多胚胎竞争，若受体出问题则胚胎全部损失殆尽，所以是增加了胚胎而使胚胎效率下降。低于4枚/只，本实验没有做，在原核注射胚胎移植时，移植数不应多于4枚/只，以有利于提高胚胎的利用效率。
(黑龙江农垦科技职业学院，陆明海;黑龙江省农科院，刘玉峰，何海娟，亓美玉;黑龙江职业学院，王素梅;东北农业大学，李武，姚玉昌)
