狍又名矮鹿、野狍，是一种珍贵的鹿科动物，在我国特种经济动物养殖业中占有重要地位，在动物分类学地位隶属于哺乳纲真兽亚纲偶蹄目反刍亚目鹿科狍属。我国是世界上野生动物资源最丰富的国家之一，狍是我国重要的狩猎动物，对人类的生活和经济发展曾起到重要作用。遗传多样性是估计种群长期生存可能性的重要指标，也是生物学上制订计划所必需的内容之一。遗传多样性对种群至关重要，它为进化提供遗传基础，遗传多样性的丧失会引起个体繁殖适合度的下降。国内有关圈养狍的生理及繁殖等方面已有深入的研究，而有关遗传多样性已有研究报道，张明海等对中国东北完达山、小兴安岭、大兴安岭、三江和吉林向海野生狍的分类地位进行分析。杨宝田等基于线粒体DNA(mtDNA)控制区部分序列探讨东北狍与西伯利亚狍、欧洲狍的遗传分化进行分析。刘艳华等对黑龙江省3个不同山系狍个体的mtDNA控制区的部分序列进行测定和群体分析，结果表明，在3个地理单元的狍种群中，大兴安岭地区的狍种群具有较高的遗传多样性，应予以优先保护，但以上研究大多集中在野生种群而忽视了圈养种群。
圈养种群的遗传多样性在优化圈养种群遗传结构，制订进一步的保护策略及放归种群的培育方面具有重要意义。长期圈养条件下，长白山狍遗传多样性有没有丧失?研究测定了圈养条件下长白山狍6个个体的mtDNA细胞色素b(Cytb)基因序列，初步从分子水平研究圈养条件下长白山狍的遗传多样性现状，同时对种群遗传多样性的变化趋势进行预测，为圈养长白山狍制订科学的繁育计划，合理调控种群结构提供科学依据。
1材料与方法
1．1样品的采集
试验用长白山狍，来自吉林市吉林农业科技学院左家校区实验基地养狍场，共采集不同个体狍抗凝血6份，置于冰瓶带回实验室，－20℃保存，备用。用全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA。
1．2Cytb基因和HSL基因的扩增和序列测定
根据GenBank中已发表的狍基因序列(登录号AJ000024)利用PrimerPremier5．0软件设计1对引物。引物序列:上游引物5'－ATGACCAATATC-CGAAAAACTC－3'，下游引物5'－TCTTCATTTTAA-GAGGTTATT－3'，预期片段扩增大小为1140bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
PCＲ反应条件:94℃预变性5min;94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环;72℃再延伸5min。PCＲ产物的纯化、回收和测序送上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1．3数据的统计分析
应用ClustalW(1．82)软件进行多序列比对，利用MEGA4．0软件计算不同序列间的核苷酸代替、变异位点、转换颠换比率及遗传距离等，利用DNAsp4．10软件计算单倍型、单倍型多样性、核苷酸多样性，利用MEGA软件计算品种间距离，利用非加权组平均法(UPGMA法)构建品种的分子系统树。
2结果与分析
2．1圈养狍mtDNACytb基因PCＲ扩增结果
通过DNA分子质量标准和测序结果可知，Cytb基因PCＲ产物大小为1140bp，与预期结果一致，见图1。
2．2圈养狍mtDNACytb基因核苷酸多态位点的突变类型
通过对12条Cytb基因序列(6条序列由本试验测定，其余6条序列来源于GenBank)进行分析，结果表明，所有序列全长均为1140bp，无插入和缺失，共发现21个变异位点，占分析位点总数的1．84%，包括14个转换和7个颠换。核苷酸的替换位点主要以转换为主，转换与颠换之比(Ｒ)为3．0，表现出较高的转换偏倚。21个变异位点定义了4种单倍型，单倍型多样性为0．644。
2．3圈养狍mtDNACytb基因系统进化分析
利用ClustalW(1．82)软件对mtDNACytb序列进行同源序列对比，结果发现，6头圈养狍mtDNACytb基因全序列由4种单倍型组成，即单倍型Ⅰ(NE1、NE2)、单倍型Ⅱ(NE3)、单倍型Ⅲ(NE4、NE5)、单倍型Ⅳ(NE6)。以梅花鹿(GenBank登录号为AB021095)的序列作为外类群，结合所有的群体单倍型序列，并引用GenBank中的部分狍Cytb基因全序列，采用UPGMA法根据本研究的测定结果，以Kimura双参数模型构建系统发育树。基于Cytb基因圈养狍与西伯利亚狍(登录号为AY070227)亲缘关系最近，两者紧密地聚为一个分支，欧洲狍单独聚合为另一个分支。圈养狍和西伯利亚与欧洲狍分属2个不同的单系群，二者间存在明显的遗传分化，见图2。
3讨论
我国是世界上野生动物资源最丰富的国家之一，狍是我国重要的狩猎动物，对人类的生活和经济发展曾起到重要作用。20世纪70年代后期，由于生态环境的破坏，我国的野生狍资源数量锐减。对野生动物实施人工圈养繁殖是增加种群数量、保护或拯救物种的重要措施之一;但是圈养条件下也面临这些问题，如近亲交配、种源枯竭的风险增加等问题。因此，对狍遗传多样性进行保护是一项紧迫的任务。目前，对于圈养条件下狍的遗传多样性研究报道较少，刘艳华等人对黑龙江不同山系狍种群遗传多样性分析结果表明，大兴安岭与小兴安岭地理单元种群间的核苷酸歧异度为2．54%，大兴安岭与完达山地理单元种群间的核苷酸歧异度为2．34%。试验测定和分析了圈养条件下6个狍样本的mtDNACytb基因全序列，并与GenBank中西伯利亚狍和欧洲狍同源序列进行分析研究，共检测到21个多态位点，占核苷酸总数的1．84%，变异位点相对较少。圈养长白山狍相对于野外种群其遗传多样性水平较低，可能是由于长期圈养所致，封闭的小居群中，长期近亲繁殖导致一些基因频率较低的等位基因没能保留下来。
狍分为欧洲狍和西伯利亚狍，国内学者认为我国狍属于欧洲狍种，而国外学者普遍认为我国狍在分类上属于西伯利亚种群，而不是欧洲种群。试验通过测定圈养狍mtDNACytb基因全序列发现，圈养长白山狍与西伯利亚狍(登录号为AY070227)亲缘关系最近，两者紧密地聚为一个分支，欧洲狍单独聚合成另一个分支。圈养狍和西伯利亚狍与欧洲狍分属2个不同的单系群，二者间存在明显的遗传分化。研究认为，我国狍应属于狍属的西伯利亚种，而不同于目前国内学者认为中国狍与欧洲狍同属于一个种的观点。试验测定了圈养条件下长白山狍mtDNACytb基因序列，定量检测出圈养种群的遗传多样性参数，为实施圈养条件狍繁殖计划和合理引进亲本提供了理论依据。由于样本量和样本地区的限制，关于中国狍的分类地位和亚种的划分还有待于进一步研究。
(吉林农业科技学院，田万年，钟宝，郑雪)
