吴静 杜雄伟 狄文婷 于凤娟 魏怡 苏日娜 大连民族学院
近几十年来， 养猪专业户为了谋求利润， 减少损失， 将各种抗菌药物用于集约化生产中来减少猪仔生病。由于抗菌药物长期不断的使用， 大肠杆菌渐渐的出现了抗药性， 耐药谱也不断扩大。媒体曾报道过超级大肠杆菌， 耐药性极强， 极不容易被杀死， 若人类感染这种超级大肠杆菌是很难治疗的。 因此， 应该积极开展猪大肠杆菌耐药性的监测， 以合理的方式用药， 竭力制止大肠杆菌耐药谱的扩增， 以最有力合理方法减少耐药菌株的出现。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
生鲜销售地共采集了猪肉样品 69 个。包括猪五花肉， 后腿肉， 肥肉， 猪皮等主要销售样品。2012 年 11 月在食用猪养殖场采集了猪饲料，饮用水， 猪粪便等样品 62 个。
质控菌： Escherichia coli ATCC25922
1.2方 法
1.2.1大肠杆菌的分离和 PCR 鉴定
切采集的样品 1~2g 放进营养肉汤培养基里， 摇匀。放进摇床，在 37℃， 150rpm 的转速下增菌 16~18h。 用 25~30mL麦康凯培养基倒平板，接种环沾菌液后在平板上 Z形划线， 放进 37℃恒温隔热培养箱， 培养 24h。将红色或粉红色不透明单菌落放进营养肉汤进行纯培养。用煮沸法制备 PCR 模板。设定 PCR 反应程序：94℃预变性 4min;94℃变性 1min,60℃退火， 72℃延伸 1min,30 个循环； 72℃延伸 7min,4℃保存。PCR 产物经电泳鉴定。
1.2.2大肠杆菌药敏试验
（1 ） 菌液制备
用营养肉汤稀释被复苏的保存菌液，用分光光度计测量稀释菌液达到 OD600=0.4～0.5。再按 1： 100 稀释菌液至含菌量约为 1×106CFU/mL， 备用。
（2 ） 微量稀释法测 MICs
将全部抗生素配为5120μg/mL 的储存液存放在冰箱中待用。将储备药液分别稀释至256μg/mL 的工作液。 在无菌的 96 孔聚苯乙烯 U 型微量板内用排枪每孔加营养肉汤 100μL，256μg/mL 的工作液 100μL 加在第一排， 混匀， 再把第一列的混合液吸 100μL 加在第二列， 以此类推同样方法操作至第 12 个孔， 最后第 12 孔的混合液吸 100μL弃去。第一板 1~8 号药品， 第二板 9~15 号药品， 最后一排的前 6 孔加菌液作为阳性对照， 后 6 孔空白营养肉汤作为阴性对照，以 Escherichia coli ATCC25922， Escherichia coli ATCC35218 作为质控。 孔板加完药品后加盖标注样品号和药品号放进培养箱， 37℃培养16h 后观察结果。
（3 ） 药敏试验判定标准
当阳性对照组细菌明显生长， 阴性对照组无细菌生长时， 以实验组小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC 值， 即小孔内溶液不变混浊所对应的最低药物浓度。当出现单一跳孔时，记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如多次出现跳孔现象， 则不记录结果， 需重新进行试验。
2结果与分析
从样品中共分离到了 69 株菌，经过 PCR 检测后 61 株为大肠杆菌， 占市场总样品数的 88%。屠宰场样品中分离到了 62 株菌，其中 56 株为大肠杆菌， 占总样品数的 90%。
2.1受试大肠杆菌耐药性分析
通过药敏试验发现大肠杆菌分离株对盐酸环丙沙星抗菌性最高， 达52 株， 占受试菌株的 88.5%， 其次为硫氰酸红霉素（85.3%） ， 土霉素 （83.6%） ， 硫酸庆大霉素 （78.7%） ，阿莫西林 （78.7%） ， 磺胺间甲嘧啶钠 （78.7%） ， 硫酸黏菌素 （75.5%） ， 烟酸诺氟沙星 （68.8%） ， 恩诺沙星（65.6%） ， 硫酸新霉素 （65.6%） ， 乙酰甲喹 （62.3%） ，乳酸环丙沙星 （57.4% ） 等具有耐药菌株分别 51 株，48 株， 48 株， 48 株， 46 株， 42 株， 40 株， 40 株， 38株， 35 株， 耐受率均超过 50%， 受试菌株对盐酸多西环素最为敏感，耐药菌株仅有 13 株占受试菌株的21.3%，其次比较敏感的是盐酸沙拉沙星耐药菌株有 22 个占总受试菌株的 36.1%，其次是氟苯尼考（45.9% ） 。
2.2重耐药性的分析
大肠杆菌的多重耐药谱：全部 61 株受试菌株均表现为多重耐药，至少是 5重耐药， 最多重数是 13 重。其中 10 重耐药菌株最多， 占全部菌株的 29.8%， 其次为 12 重 （22.9%） ， 11重 （9.8%） ， 7 重(9.8%),13 重 （8.2%） ， 6 重 （6.5%） ， 9重 （4.9% ） ， 8 重 （4.9% ） ， 5 重 （3.2% ） 。13 重耐药有 3种耐药谱； 12 重耐药有 5 种； 11 重耐药有 3 种； 10重耐药有 8 种； 9 重耐药 1 种； 8 重耐药 3 种； 7 重耐药 4 种； 6 重耐药 1 种； 5 重耐药 1 种。其中 12 重耐药中 FLO-NEO-AMO-NOR-ERY-SOL-C/L-COL-TER-ENR-CIP-EMQ 最常见， 共有 5 株 （8.2% ） 菌株表现为此耐药谱。
目前， 细菌的耐药现象己经十分严重， 并有逐年上升趋势， 导致临床治疗效果差、 治疗时间延长、死亡率和临床发生率增加、 治疗费用上涨。细菌耐药菌株的传播和多重耐药菌株的出现， 是导致各类传染病治愈受限的主要原因之一。
本研究对 61 株大肠杆菌进行了 15 种抗生素的耐药性分析。结果这些菌对 15 种抗生素的耐药性均在 20%以上。 最高达到 88.5%， 是对盐酸环丙沙星， 耐药性最小 21.3%， 是对盐酸多西环素。由此来看， 大连猪源大肠杆菌的耐药性明显提高， 致使许多养殖场越来越增加药品的用量。我国尚未建立完善的抗生素管理体系， 这样的恶循环不断出现， 滥用抗生素的行为导致细菌的耐药性会越来越高， 经济损失也将越来越大。
现如今， 提倡合理使用抗生素， 联合用药， 交叉用药或者研发新型抗生素， 进一步研究大肠杆菌的耐药机制和耐药谱， 方可实现对其耐药性的有效控制。
