广东某猪场饲养母猪800头，保育猪与生长育肥猪分栋饲养。保育阶段猪呼吸道疾病症状明显，每批刚转入保育阶段2w的断奶仔猪即有轻微咳喘、呼吸困难等临床症状，早则35日龄，晚则55日龄开始发病。发病率约40%，未治疗病死率高达100%。即使采取治疗措施，病死率也达到60%以上。整个病程持续2～4w。主要症状表现为眼结膜潮红，喘气、腹式呼吸，嗜睡，厌食，耳、腹下皮肤呈紫色，有点状出血；有些出现关节轻微肿胀、跛行，双眼肿胀，腹泻，精神萎靡等。华南动物疫病检测中心对猪场发病猪进行实验室诊断并提出了防治措施。现报道如下：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料
3头发病保育猪，来源于广东省某规模化猪场发病仔猪。
1.1.2主要试剂及培养基
药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂TSA、胰蛋白胨大豆肉汤TSB、胰蛋白胨、酵母提取粉、NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、新生小牛血清购自广州威佳科技有限公司；TaqDNA聚合酶、MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit、PrimeScriptOneStepRT-PCRKit、pMD18-Tsimplevector、premixEXTaq、DL2000DNAMarker、DH5α感受态细胞均购自宝生物工程(大连）有限公司；GelEx-tractionKit购自OMEGA公司；细菌DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；副猪嗜血杆菌特异性引物由深圳华大基因科技有限公司合成。
1.2方法
1.2.1细菌分离培养及形态学观察
无菌条件下，采取病猪组织(肝、肾、心包液、关节液等)分别接种在TSA血平板、巧克力琼脂(含NAD和酵母浸膏)平板，37℃培养18～24h，然后进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察。
1.2.2药敏试验
挑单菌落接种到TSB兔血NAD液体培养基中培养至对数生长期，取100μL菌液涂于巧克力琼脂平板，使用K-B法进行药敏试验，根据NCCLS(2006)的标准判定。
1.2.3细菌的PCR鉴定
根据已报道的检测方法[1]，将分离的细菌抽提DNA，按照细菌DNA抽提试剂盒说明书完成。抽提好细菌DNA后，进行PCR反应。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，运行30个循环；最后72℃延伸10min。PCR完成后，取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外投射仪中观察结果。
1.2.4猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及序列测定
参照GenBank猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因序列设计检测引物，对病猪的肺组织进行RT-PCR。将目的片段胶回收纯化后，克隆入pMD-18T，送北京华大基因研究中心测序。
2结果
2.1病理变化
剖检发现：病猪均出现弥漫性间质性肺炎，肺实变，气管和支气管有血性黏液渗出物；心包膜和胸腔大量积液，心脏有大量出血斑，有明显的“绒毛心”现象；喉头出血；肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结肿大、充血、出血；脾边缘出血梗死；胸腔及腹膜有纤维蛋白渗出。图1、图2、图3。
2.2细菌分离培养及形态学观察
分离培养得到的细菌经革兰氏染色后镜检，见分离菌形态多样，从单个球杆状到长、细长以及短丝状，为革兰氏阴性小杆菌。
2.3药敏试验
参照NCCLS(2006)标准以敏感(S)、中等(I)、耐药(R)3种形式依抑菌圈大小进行判断。实验结果表明，分离菌对头孢噻呋、头孢噻吩、环丙沙星、诺氟沙星等高度敏感；对克林霉素呈中度敏感；对氨苄西林、土霉素、阿莫西林、红霉素呈低度敏感（表1）。
2.4分离菌的PCR鉴定
PCR产物经凝胶电泳后检测的条带大小约为820bp，与预期结果相符，如图4。测序结果在GenBank中进行blast比对，鉴定分离菌a、分离菌c和分离菌d均为副猪嗜血杆菌。
2.5猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测与测序比较
在所采肺脏组织中均扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性目标条带(如图5)。测序后将结果用DNAStar软件分析发现，NSP2基因与2006年国内流行的高致性变异病毒株一致，且与流行代表毒株JXA1株的相似性为96.5%。说明发病猪感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株。
综合以上实验结果：副猪嗜血杆菌和繁殖与呼吸综合征病毒变异株均为阳性，结合临床表现，判定该猪场本次爆发的疫病是由繁殖与呼吸综合征病毒变异株和副猪嗜血杆菌混合感染导致。
3防治
根据诊断结果采取了以下防控措施：
3.1严密封锁猪场，隔离病猪，防止疫情扩散
严密封锁猪场；对发病猪群进行监测，一旦发现疑似病猪立即隔离饲养；对发病严重没有治疗价值的猪进行紧急扑杀，对流产的胎衣、死胎及死猪进行无害化处理；全场采取严格消毒措施，防止疫情扩散。
3.2加强饲养管理，加强通风换气，做好清洁消毒工作
改善饲喂条件，降低饲养密度，加强通风，保持猪舍干燥，减少应激。严格控制饲料的质量，禁止饲喂霉变饲料。
3.3病猪治疗
根据诊断，病猪主要是由繁殖与呼吸综合征病毒变异株和副猪嗜血杆菌混合感染导致，因此治疗时主要采取抗病毒和抗细菌疗法相结合，同时对症治疗。药敏试验结果显示主要的敏感药物有：头孢噻呋、头孢噻吩环丙沙星、诺氟沙星等。治疗时选用诺氟欣全群拌料，每吨饲料添加诺氟欣2500g；不吃料的采用肌肉注射赛福呐(头孢噻呋钠)，每千克体重5mg，以控制细菌感染。
3.4紧急免疫
对后备母猪和妊娠母猪、公猪接种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)，以21d的间隔，共进行免疫2次，每头猪1头份。此外加入维康乐(每升水中药物有效含量为1g)，提高猪的免疫力。
采用上述综合防控措施，发病率和死亡率均明显下降，该猪场的病情逐步得到控制。2个月后疫病基本平息并恢复到发病前的生产水平。
4讨论
当繁殖与呼吸综合征病毒侵入猪体后，病毒被机体内的巨噬细胞吞噬。吞噬后的病毒其繁殖能力反而增强，从而使肺泡巨噬细胞的功能下降，继而病猪出现呼吸道症状。随着病情的发展，病毒又扩散到局部的淋巴组织和全身的单核细胞与吞噬细胞中，从而导致机体的免疫力大大下降。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道常在菌，当猪体的免疫能力低下时容易发病[2]。细菌感染后，由于未能科学地用药导致耐药菌株的不断增多、耐药谱日益扩大[3]。有研究发现，当猪感染繁殖与呼吸综合征病毒时，在猪体内很容易检测到副猪嗜血杆菌。副猪嗜血杆菌病有蓝耳病的影子病之称[4]。
目前猪病的发生基本上都是混合感染，仅通过流行病学调查、临床剖检等方法却很难分辨，必须通过实验室检测才能确诊。如主要通过PCR、RT-PCR[5]、RT-LAMP[6]、ELISA[7]等方法进行实验室诊断，必要时可做动物回归实验[8]。
以高致病性繁殖与呼吸综合征为主的重大疫病危害巨大，要高度重视其综合防控，尤其要做好平时的免疫接种。在当今的养猪生产过程中，要加强饲养管理，定期对圈舍进行彻底清扫和消毒，饲喂营养全面的饲料，对小猪采用少食多餐制以增强其体质。定期对猪场进行血清学和病原学监测，以便制定科学的免疫程序和对带毒猪进行淘汰等。
本次猪场疾病发病快、传播广、感染率高、死亡率高，综合诊断为混合感染，根据治疗措施降低了猪的死亡率。所以，针对混合感染或多重感染，要根据猪场疫病流行特点、临床症状、病理剖检及实验室检测进行综合诊断。根据诊断结果对症下药，避免不合理用药(含抗菌药物)而导致更高的死亡率。
（1.甘肃农业大学动物医学院，裴仉福，胡永浩；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，裴仉福，，陈瑞爱，张显浩，刘好朋；3.华南农业大学兽医学院，陈瑞爱，贺东生）
