猪链球菌是一种重要的人兽共患传染病病原。近年来，世界各国不断发生猪链球菌致人发病和死亡病例，特别是2005年6-8月，四川省发生了国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫情，发病204例，死亡38例，病死率高达18.63%[1]。猪链球菌广泛存在于自然界，除感染猪和人外，已有不少关于猫、犬、牛、羊、马、鹿及啮齿类动物，甚至鸟类和鱼类感染本病的报道[2-7]。广东省是养猪和猪肉消费大省，由于猪链球菌可通过皮肤上的伤口侵入机体引起发病，因此，与人类密切接触的宠物及其他食用动物如果携带猪链球菌，将对人类健康造成巨大的潜在威胁。本研究针对广东地区多种食用动物（猪、禽类、鱼类）及宠物等与人类密切接触的动物及其产品的猪链球菌带菌情况进行监测，并进一步对分离培养得到的菌株进行生化反应特性及耐药性等研究，以期掌握广东地区人及动物猪链球菌宿主分布情况及流行病学信息。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
2010年5月至2013年6月，分别从广东不同地区的农贸市场及超市等分批采集样本，采样动物包括（1）猪：猪肉、心、肝、脾、肺、肾等；（2）食用鱼类：罗非鱼、皖鱼、鲫鱼、塘鲺等；（3）食用禽类：鸡、鸭、鹌鹑、鸽子等；（4）物：犬、猫；（5）老鼠。采样部位：禽类及哺乳动物的口腔拭子、鱼类的口腔、腮，猪肉类的新鲜切口。用灭菌棉签取样后置于装有2.5mLTHB液体培养基的试管中，于37℃恒温摇床200r/min震荡培养。
1.1.2主要试剂
新生牛血清，购自广州鼎国生物技术有限公司；一次性血平板，购自广东环凯微生物科技有限公司；Todd－HewittAger（THA）和Todd－Hewittbroth（THB）由本实验室配制。微量发酵管和药敏试验纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.2方法
1.2.1猪链球菌的分离培养及形态特征鉴定
当上述菌液振荡培养4h后，取部分菌液接种于血平板上，37℃培养16～18h。每个样本选取呈光滑、圆形、半透明、边缘整齐，直径约为1～2mm的小菌落3～5个接种于3mLTHB培养基中，37℃培养16～18h进行PCR鉴定。同时对血平板培养物进行革兰染色，镜检观察细菌形态。
1.2.2猪链球菌的PCR鉴定
根据猪链球菌16SrRNA序列设计合成引物，用于检测分离培养后的样本中的猪链球菌[8]。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μL，10pmol/L上游引物1μL，10pmol/L，下游引物1μL，25mmol/LdNTP2μL，r-TaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL，用ddH2O补齐至总积25μL。将扩增后的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.2.3猪链球菌的PCR分型
利用实验室设计合成的型特异性引物，对分离到的猪链球菌进行血清型分型[9]。
1.2.4猪链球菌的生化试验
将分离得到的猪链球菌接种于THB液体培养基，37℃培养16～18h后，用10μL灭菌枪头吸取菌液后滴加1～2滴至微量发酵管中，将其置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察并记录结果。
1.2.5猪链球菌的药敏试验采用纸片扩散法对分离到的猪链球菌行药敏试验分析。
2结果
2.1不同宿主来源样品中猪链球菌的检出率
本次调查从广东不同地区共采集样本848份，经鉴定从待检样品中的猪肉、猪肺、鸽子、鹌鹑、鹧鸪、鸡、鸭和猫中共分离得到猪链球菌31株，其余种类待检样本未分离到猪链球菌，阳性样本的具体分布见表1。
2.2猪链球菌的血清型分型结果
经PCR鉴定，确定上述阳性样本中猪链球菌血清2型1株、8型1株、9型11株、18型1株、26型1株、31型1株。
2.3猪链球菌的生化试验
31株猪链球菌均能够发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、菊糖、海藻糖和水杨苷；不发酵甘露醇、6.5%NaCl、马尿酸钠、山梨醇。
2.4猪链球菌分离菌株的药敏试验
经检测分离到的31株猪链球菌对13种抗菌药物呈现不同程度的耐药性，总体来说31株菌株对先锋霉素V、先锋霉素Ⅵ、阿莫西林、氟苯尼考、奥复星耐药率较低；而对乙酰螺旋霉素、复方新诺明、强力霉素、新霉素、林可霉素、四环素、磺胺异恶丙唑和菌必治则明显的耐药，且均为多重耐药。多重耐药分析的结果显示，不存在耐4种及4种以下药物的菌株，而耐7～11种药物的多重耐药菌株所占比例较高，其中耐7种药物的菌株比例最高达到25.81%（表2）。
3讨论
近些年来，人兽共患猪链球菌病在我国时有暴发流行，严重影响养猪业和社会公共卫生安全。然而，到目前为止有关其病原生态学、流行病学的一些问题尚未完全明了，尤其是各种动物对人兽共患猪链球菌的易感水平和人际感染风险等研究资料更为缺乏。本研究对广东地区的猪、禽类、水生动物及宠物等与人类密切相关的动物体内猪链球菌带菌情况进行调查，并进一步对分离培养得到的菌株进行生化反应特性、耐药性等方面的鉴定分析，初步掌握了广东地区猪链球菌在不同宿主中的分布情况及其分子流行病学特点。
我们主要选择了人们日常饮食中接触最密切的动物，包括猪肉类、禽类和鱼类等，以及与人类生活密切相关的宠物和环境中的老鼠作为样本，这些动物一旦感染猪链球菌或成为病愈后带菌动物，其排泄物和分泌物均含有病原菌，成为新的潜在的传染源，将大大增加进一步发生更大范围感染的危险。因此，应更为重视对潜在传染源的监测工作。
据国内外研究报道，猪链球菌可分为35个血清型，其中1型、2型、7型、9型、14型及22型是常见的致病性菌株[10]。本研究中经PCR鉴定分离株的血清型，定型的菌株中以9型为主，所占比例约为阳性样本的35.6%，临床中常见的1型、7型菌株未分离到，而其他几种临床常见的猪链球菌血清型仅各分离到1株，提示不同宿主对血清9型猪链球菌可能更易感。
本研究中，从不同宿主体内分离到的猪链球菌药敏检测试验的结果显示，分离株对同一种药物的敏感性有很大的差异，但所有菌株都呈现多重耐药，表明不同宿主感染的猪链球菌耐药现象较为严重。
猪链球菌病作为一种人兽共患病，还没有证据证明可以在人与人之间传播。目前为止确定的人感染猪链球菌病病例均是直接接触感染。本次调查的结果显示，多种与人密切接触的动物源性食品和宠物猫中均携带有猪链球菌，提示我们应加强对这些样本的监测工作，提高防护意识。此外，对本研究分离到的不同宿主源猪链球菌的致病性等还需进一步研究。
（1.广东省农业科学院动物卫生研究所，李淼,杨冬霞，宋帅，岳磊，李春玲；2.广东省动物防疫物资储备中心，谢乐新）
