本标准规定了牛脂肪组织中马波沙星残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱（LC-MS）测定方法。
本标准适用于牛脂肪组织中马波沙星残留的定性和定量测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
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3 制样
3.1 样品的制备
取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，并使均质。
3.2 样品的保存
-20℃以下保存。
4 测定方法
4.1 方法提要或原理
牛脂肪中残留的马波沙星用5%三氯乙酸溶液（TCA）和含1%乙酸的乙腈溶液提取（V/V=8∶2），正己烷除脂，以马波沙星-D8为内标，用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
4.2 试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.2.1 马波沙星对照品：含量≥98.0%。
4.2.2 马波沙星-D8对照品：含量≥98%。
4.2.3 甲醇：色谱纯。
4.2.4 甲酸铵：色谱纯。
4.2.5 甲酸：色谱纯。
4.2.6 乙酸。
4.2.7 三氯乙酸（TCA）。
4.2.8 二甲基亚砜。
4.2.9 正己烷。
4.2.10 1mol/L甲酸铵溶液
称取3.15g甲酸铵，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
4.2.11 5%三氯乙酸（TCA）
称取50.0g三氯乙酸，置1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
4.2.12 含1%乙酸的乙腈溶液
量取500ml乙腈和10ml乙酸，置1000ml容量瓶中，混匀，用乙腈稀释至刻度。
4.2.13 马波沙星标准储备液（1000µg/ml）
取马波沙星对照品约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，配制成为浓度为1000µg/ml的马波沙星标准储备液。－18 ℃以下保存，有效期6个月。
4.2.14 马波沙星-D8内标储备液（100µg/ml）
取马波沙星-D8对照品0.5mg，精密称定，置5ml容量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100µg /ml的马波沙星-D8内标储备液。－18 ℃以下保存，有效期6个月。
4.2.15 马波沙星标准工作液（2μg/ml）
精密量取马波沙星标准储备液适量，用乙腈稀释成浓度为2μg/ml的标准工作液。现用现配。
4.2.16 马波沙星-D8内标工作液（1.2μg/ml）
精密量取马波沙星-D8内标储备液适量，用乙腈稀释成浓度为1.2μg/ml的内标工作液。现用现配。
4.3 仪器和设备
4.3.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。
4.3.2 分析天平：感量0.00001g；感量0.0001g。
4.3.3 天平：感量0.01g。
4.3.4 匀浆机。
4.3.5 离心机。
4.3.6 涡旋混合器。
4.3.7 离心管：50ml。
4.3.8 试管：10ml。
4.3.9 棕色容量瓶：5ml，50ml，100 ml。
4.3.10滤膜：0.22μm。
4.4 测定步骤
4.4.1试样的制备
取新鲜或冷冻空白或供试组织，剪碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试样。
——取均质后的空白样品，作为空白试样。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
4.4.2试样保存
－20℃以下保存。
4.4.3 提取
称取试样（2 ± 0.01）g，置50 ml离心管中，添加1.2μg/ml马波沙星-D8内标工作液适量，加5%TCA溶液和含1%乙酸的乙腈溶液（V/V=8∶2）5ml，振荡5min， 10000r/min 离心10min，取上清液1.5ml于10ml试管中，加正己烷2ml，涡旋1min，静置5min，取下层清液1ml，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱分析测定。
4.4.4 标准曲线的制备
精密量取2μg/ml马波沙星标准工作液和1.2μg/ml马波沙星-D8内标工作液适量，用空白脂肪提取液稀释，配制成马波沙星-D8浓度均为120ng/ml以及马波沙星浓度为6、10、20、80、160、200、340和400ng/ml的系列标准工作液，供液相色谱-串联质谱分析测定。以马波沙星特征离子质量色谱峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，以马波沙星浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程和相关系数。
4.4.5 测定
4.4.5.1 液相色谱条件
色谱柱：C18 柱 （2.0 mm×150 mm，粒径5μm）， 或效能相当者；
流动相：流动相A为1000ml水+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸铵溶液；流动相B为1000ml甲醇+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱条件参见表2；
流速：0.25 ml/min；
柱温：30℃；
进样量：5μl。
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
气体温度：350℃；
辅助气：N2；
辅助气流速：9.0L/min。
目标化合物定性、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表3。
4.4.5.3.1 定性测定
通过试样色谱图的保留时间与相应标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准溶液保留时间的相对偏差不大于5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。
取试样溶液和标准溶液，做单点或多点校准。按内标法以峰面积比定量。标准溶液及试样溶液中的马波沙星响应值均在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，马波沙星标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图见附录A。
4.4.6 空白实验
除不加试样外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
4.5 结果计算和表述
4.5.1 单点校正法
X为试样中马波沙星的残留量（μg/kg）；
A为试样溶液中马波沙星峰面积；
As为标准溶液中马波沙星峰面积；
A1内为试样溶液中内标物峰面积；
A2内为标准溶液中内标物峰面积；
Cs为标准溶液中马波沙星浓度（ng/ml）；
V为试样最终定容体积（ml）；
m为试样的质量（g）。
注：计算结果需要扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
4.5.2 多点校正法
X为试样中马波沙星的残留量（μg/kg）；
C为根据标准曲线计算得到的试样中马波沙星的浓度（ng/ml）；
V为试样最终定容体积（ml）；
m为试样质量（g）。
注：计算结果需要扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
5 方法灵敏度、准确度和精密度
5.1 灵敏度
本方法检出限为7.5μg/kg，定量限为25μg/kg。
5.2 准确度
本方法在25μg/kg～100 μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%～120%。
5.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
