邹明峰 薛佳 白林
四川省来恩畜牧有限公司
猪精液冷冻技术始于 20 世纪 50 年代，是指利用干冰 （-79 ℃） 、 液氮 （-196 ℃） 、 液氦 （-269 ℃） 等作冷却源， 将猪精液经特殊处理后冷冻， 保存在超低温液氮 （-196℃ ） 状态下， 以达到长期保存的目的。由于冻精可以使良基因得到无限期的保存，延长公猪使用年限， 而不受该公猪死亡、 损失、 采精间隔或繁殖不育的限，有利于人为使用高性能水平的种公猪与较多数量的母猪配种， 获得更大的遗传进展。猪精液冷冻技术涉及多个步骤，主要包括： （1 ）公猪精液的采集； （2 ） 精液稀释液的配制； （3 ） 精液预处理； （4 ） 精液冷冻； （5 ） 精液保存； （6 ） 冻精解冻。其核心步骤是猪精液的冷冻、 保存及冻精解冻。
1精液的冷冻
1.1冷却源
猪精液冷冻的冷却源主要有干冰 （ -79℃ ） 、液氮 （-196℃ ） 、 液氦 （-269℃ ） 。目前主要以干冰与液氮为主。研究表明， 使用干冰作为冷源制作的冻精在解冻后的精子活力略高于使用液氮作为冷源制作的冻精。但由于干冰造价高于液氮且不易保存， 因此实际生产中仍以液氮为主要冷却源。使用液作为冷源制作冻精的方法，目前主要有 2 种： 细管冷冻法， 液氮颗粒冷冻法。由于颗粒冷冻精液较难进行不同头份 （来源） 的区别， 且容易造成交叉污染而细管冷冻法的优点是不像颗粒冻精一样容易受污染， 且容积小、 冷冻快， 受胎率也较高，所以细管冷冻法在实际生产中的应用较多。目前， 研究者在细管冷冻法的基础上通过不断优化液氮面平衡高度与冻精管直径的大小来提高冻精的质量。液氮面平衡高度为 5cm 时， 最适合使用 0.25mL 细管；5mL 大管在 3cm 平衡高度时使用效果最好。
1.2精液稀释
猪精液稀释液为猪精液提供了必要的生存环境。研究者在常规的稀释液中添加 Equex.STM （一种合成乳化清洁剂， 与卵黄共同作用能有效抑制顶体的异常变化） ，结果显示：添加 Equex.STM的稀释液对冻精活率有提高，与常规稀释液相比差异不显著 （P>0.05 ） ， 但对冻精顶体完整率却有极显著的提高（P<0.01 ） ，在一定程度上使冻精质量有所改善。
1.3冷冻速率
冷冻速率对猪精液的冷冻至关重要， 在冷冻精液制作过程中必须提高冷冻速度， 温度须持续下降， 不能出现回升现象。精液在冷冻过程中应快速通过危险温区 （0～-60 ℃） ， 这样才能提高冻精解冻后的活率。有研究表明， 采用 50 ℃/min， 平衡温度-120℃、 10min， 精液的冷冻效果较好。 理想的冷冻速率推荐为： 0.5mL 细管采用 30℃/min、 3％甘油浓度， 或 0.25mL 细管采用 50℃/min、 3％甘油浓度。
2猪精液的保存
精浆是精液的重要组成部分，具有调整精液pH 值， 为精子提供营养物质， 防氧化等生理作用。精浆在冷冻精液中能乳化类脂、稳定精子膜中的类脂，减小或抑制由于超低温冷冻保存而造成的类获能性变化， 从而起到保护精子的作用。有研究表明，添加 10%精浆冷冻保护剂对冻融后精子的品质有提高作用。一定浓度的精浆冷冻保护剂对猪精液的冷冻保存有利， 但若浓度过大， 却不利于冷冻精子存活。
3猪冻精的解冻
解冻是猪精液冷冻保存的关键一步，让精子在解冻后迅速复活力是十分重要的。目前常用的解冻液有 Glucose-EDTA 解冻液与 DPBS-BSA 解冻液。由于含糖的 Glucose-EDTA 解冻液给解冻精子及时补充了能量物质， 相对于不含糖含 BSA 的 DPBS-BSA解冻液来说， 前者更能使精子快速恢复活力。在实际生产中，推荐使用 Glucose-EDTA 解冻液用于冻精的解冻。
冷冻到-196℃的冻精在解冻过程中精子要两次经过临界温度区 （-60℃和-15℃） 。为使解冻后精子仍能存活，只有通过适宜的解冻方法才能确保其复活。适当的解冻温度能使冷冻精子快速越过危险温区， 使玻璃化快速越过结晶态直接变为液态， 降低对精子的伤害。Olesenz 等直接把 0.25mL 微细管放于70℃水浴中解冻 8s； Woelders 等的解冻方法是在 39℃水浴中解冻 30s。目前研究证， 37℃、 30s 水浴解冻方法更适合 0.25mL 细管猪冻精的解冻； 颗粒冻精解冻适用干解法： 40~45℃、 8~10s 即可使精子的平均活率达到最高。
研究人员今后还需对猪精液冷冻技术的各关键步骤进行优化调节，例如使用均匀降温的方式生产冻精，使用高效的冷冻液等方式来提高冻精的使用效果。
